枯草芽孢桿菌SH7抑菌蛋白的分離純化及對煙草青枯病菌的抑制作用

張秀玉，孔凡玉，王 靜，張成省，李佰樂

(國家煙草專賣局煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為植物病害主要生防細(xì)菌之一，廣泛分布于自然界中，因其是對人畜無害、不污染環(huán)境的非致病細(xì)菌，備受各國研究工作者的青睞。很多優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1-3]。Bacillus subtilis 在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生不同種類的拮抗物質(zhì)，主要為抗生素和抗菌蛋白[4-5]。國內(nèi)對Bacillus subtilis及其代謝產(chǎn)物對植物病原菌的生物防治研究也很多，主要對不同 Bacillus subtilis 菌株抗菌蛋白的分離、純化、理化性質(zhì)及其抑菌機制的研究[6-7]。

從煙草根際土壤分離到 1株對煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有較強拮抗作用的生防細(xì)菌SH7(經(jīng)細(xì)菌常規(guī)及16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌[8])，且其無菌發(fā)酵液對煙草青枯病的溫室盆栽試驗防效較好，并初步證明了該菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)[9]。本實驗對SH7菌株產(chǎn)生的拮抗蛋白進(jìn)行分離純化，并初步研究了該抑菌蛋白對Ralstonia.solanacearum的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拮抗菌株： Bacillus subtilis SH7，分離自煙草根際土壤。

指示菌：Ralstonia solanacearum，來自中國科學(xué)院植物保護研究所。

1.2 供試培養(yǎng)基

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（NB）：每升水含葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，pH 7.0。牛肉膏蛋白胨淀粉培養(yǎng)基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g氯化鈉，2 g淀粉，20 g瓊脂，1000 mL水，pH 7.4。

淀粉酶種子培養(yǎng)基：5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCL，5 g可溶性淀粉，1000 mL水，pH7.0。

淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g玉米粉，15 g黃豆餅粉，0.2 g氯化鈣，0.2 g硫酸鎂，2.5 g氯化鈉，2g磷酸氫二鉀，0.75 g硫酸銨，2 g磷酸氫二鈉，1000 mL水，pH7.0。

1.3 主要試劑

酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID有限責(zé)任公司，DEAE Sepharose Fast Flow購自GE Healthcare公司，Sephadex G-75購自Pahaimacia公司，丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、聚乙二醇 8000購自北京索萊寶科技有限公司，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自天根生化科技有限責(zé)任公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 粗提拮抗物的確定

將SH7接種于含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，4 ℃下8000 r/min離心15 min去菌體，在上清液中加入硫酸銨至30%,50%, 70%, 90%不同飽和度，將各級沉淀所得蛋白透析脫鹽即為蛋白粗提液，牛津杯擴散法法檢測其對R.solanacearum的活性測定。

1.5 抑菌蛋白的分離純化

1.5.1 抑菌蛋白的分離 將有活性的蛋白粗提液用上樣緩沖液( 0.02 mol/L Tris-HCL, pH 8.0 ) 充分透析后, 進(jìn)行DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，再用含0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mol/L的氯化鈉的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分部收集樣品，透析脫鹽，檢測對煙草青枯病菌的抑菌活性。

1.5.2 抑菌蛋白的純化 將有抑菌活性的收集樣品濃縮再進(jìn)行Sephadex G-75凝膠過濾層析，用500 mL 0.02 mol/L Tris-HCL洗脫，收集樣品，透析脫鹽后檢測其對煙草青枯病菌的抑菌活性，-25 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 抑菌蛋白純度與相對分子質(zhì)量測定 方法參照文獻(xiàn)[10]。聚丙烯凝膠電泳濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，分別在80 V和100 V下做恒壓電泳。染色采用考馬斯亮藍(lán)染色法和硝酸銀染色法[11]相結(jié)合。

1.6 抑菌蛋白淀粉酶活力的測定

將 1.5.2中具有活性的蛋白利用牛津杯定量擴散法在牛肉膏蛋白胨淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，利用革氏碘液(1.0 g碘，2.0 g碘化鉀，300 mL水)顯色法，測定活性蛋白是否具有淀粉酶活性。再用碘量法測定所生成的葡萄糖的含量來計算淀粉酶活力。

1.7 抑菌蛋白對煙草青枯病菌的拮抗作用

在100 mL NB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中按 1:20的接種量同時接入抑菌蛋白和煙草青枯病菌，30 ℃搖床中150 r/min培養(yǎng)48 h；同時設(shè)相同條件下培養(yǎng)煙草青枯病菌為對照，每處理3次重復(fù)；8000 r/min離心 15 min去菌體；以 V(上清液):V(無水乙醇)=1：3加入乙醇，混勻，靜止過夜，在12000 r/min下離心2 min，棄上清，用75%乙醇沖洗沉淀[12]，在50 ℃烘箱中放置6 h，烘干后剩余沉淀即為胞外多糖粗提物，分別測定其質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1 抑菌蛋白的分離純化

2.1.1 硫酸銨飽和度的確立 抑菌蛋白粗提液經(jīng)硫酸銨分級沉淀透析脫鹽后，通過對煙草青枯病菌的活性測定，得知在 0～30%沉淀段的蛋白對煙草青枯病菌的抑菌活性最大，而 30%～50%，50%～70%和 70%～90%基本沒有抑菌活性，表明此飽和度沉淀出來的蛋白多為雜蛋白，不含抗菌蛋白，由此確定分級鹽析的飽和度為0～30%。

2.1.2 抑菌蛋白純度與相對分子質(zhì)量測定 經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析，對有活性的蛋白進(jìn)行非變性膠聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色法和硝酸銀染色得單條帶，蛋白的相對分子質(zhì)量為 33.6 kD (圖 1)。

2.2 抑菌蛋白淀粉酶活力的測定

利用革氏碘液顯色，由圖2可以看出，抑菌蛋白具有淀粉酶活力，是一種胞外蛋白酶。經(jīng)碘量法測定所生成的葡萄糖的含量來計算淀粉酶的活力為15.76 mg/mL。

圖1 枯草芽孢桿菌SH7純化抑菌蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE pattern of purified protease from Bacillus subtilis strain SH7

2.3 抑菌蛋白對煙草青枯病菌抑制作用

單獨接煙草青枯病菌得到的胞外多糖含量為0.62 mg/mL，而同時接活性蛋白和煙草青枯病菌得到的胞外多糖含量為0.46 mg/mL，小于單獨接煙草青枯病菌的胞外多糖含量，從而可以看出抑菌蛋白抑制了煙草青枯病菌分泌胞外多糖的量。

3 小 結(jié)

本實驗純化了電泳純的SH7分泌的抑菌肽，其相對分子質(zhì)量為 33.6 kD，且具有淀粉酶的活性，能減少煙草青枯病菌胞外多糖的分泌。對于生防芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌肽類對植物病原菌的拮抗作用，國內(nèi)外已有較多研究[13-15]，而對其具有淀粉酶活性的研究還較少，SH7分泌的抑菌肽的淀粉酶活力與胞外多糖的減少是否相關(guān)有待進(jìn)一步研究。同時作者已證實SH7菌株對煙草具有促生作用，對其他作物青枯病菌、煙草黑脛病和煙草赤星病菌具有良好的拮抗作用(另文報道)，本實驗為以后對抑菌肽的進(jìn)一步純化、測序及構(gòu)建多功能生防菌株奠定了基礎(chǔ)，為SH7菌生防制劑的產(chǎn)業(yè)化及田間應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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