促紅細胞生成素對腦缺血/再灌注損傷的保護作用*

楊彥玲，朱文俠，陳雅慧，陳美霓

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

促紅細胞生成素(erythropoietin，Epo)是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白，主要作用是調(diào)節(jié)血液中紅細胞的生成。目前發(fā)現(xiàn)，在正常人腦和缺血腦組織中都有 Epo及其受體(Epo receptor，Epo-R)表達[1，2]，但 Epo在腦缺血/再灌注后神經(jīng)保護作用及其機制尚未完全明了。為此，本實驗采用大鼠腦缺血/再灌注模型，觀察外源性Epo對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用，為臨床應(yīng)用Epo治療缺血性腦血管病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠32只，雌雄不限，清潔級，體重(300±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與藥品 重組人Epo注射液由沈陽三生制藥股份有限公司生產(chǎn)，NO試劑盒、SOD活性檢測試劑盒及MDA水平檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 4%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉后，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉兩側(cè)頸總動脈30min(動物出現(xiàn)呼吸加快，肢體痙攣，在19 s～1 min內(nèi)出現(xiàn)昏迷)，松開動脈夾后即再灌注，動物分別在5～10min蘇醒，再灌注24h。

1.2.2 動物分組 32只大鼠隨機分成假手術(shù)組、腦缺血/再灌注組、Epo組及陽性對照組(尼莫地平，nimodipine，Nim)4組(n=8):假手術(shù)組，分離雙側(cè)頸總動脈，縫合，其余大鼠均建立大鼠腦缺血/再灌注模型，缺血30min再灌注24h。假手術(shù)組、腦缺血組于再灌注前腹腔注射生理鹽水，Epo組于再灌注前腹腔注射3000U/kg Epo，陽性對照組再灌注前腹腔注射0.5 mg/kg Nim?？p合皮膚回籠飼養(yǎng)。

1.2.3 血清NO的測定 再灌注24h后麻醉大鼠，摘除眼球取血 1.5 ml，4℃ 4000r/min離心 10min，分離血清-20℃冰箱保存。待測血清NO水平。

1.2.4 海馬區(qū)腦組織取材 開胸暴露心臟經(jīng)左心室主動脈插管，快速灌注4℃生理鹽水，迅速打開顱腔，斷頭取腦，取左右側(cè)海馬區(qū)腦組織-80℃冰箱凍存，待檢測生化指標及腦組織含水量。

1.2.5 海馬區(qū)腦組織SOD活性及MDA含量檢測 稱重右側(cè)腦組織，用JY92-II型超聲細胞粉碎機使細胞破碎，400A，每次5 s，間隔10s反復(fù)3～5次，制成10%的腦組織勻漿(冰浴勻漿)。0℃4000r/min離心15 min，取上清液。硫代巴比妥酸法測定海馬區(qū)腦組織MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.2.6 腦組織含水量的測定 取大鼠左側(cè)海馬區(qū)腦組織，經(jīng)電子分析天平(分度值0.1 mg)精確稱量，120℃恒溫干燥箱烘烤48 h至恒重，稱干重，計算含水量。含水量%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清NO的變化

假手術(shù)組大鼠血清NO水平為(1.89±0.39)μmol/L，缺血/再灌注后NO水平顯著升高，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。表明缺血/再灌注后有大量NO的產(chǎn)生。Epo組大鼠血清NO顯著下降，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.01)，陽性對照Nim組大鼠血清NO顯著下降，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.01，表1)。說明 Epo可以明顯降低腦缺血/再灌注后NO的水平。

2.2 腦組織勻漿中MDA含量的變化

假手術(shù)組大鼠腦組織勻漿中MDA含量為(23.3±5.4)nmol/mg pro，缺血/再灌注后MDA水平顯著升高，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。EPO組大鼠腦組織勻漿中MDA含量顯著下降，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.01)，陽性對照Nim組大鼠腦組織勻漿MDA含量顯著下降，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.01，表1)。提示Epo抑制腦缺血/再灌注損傷所致的脂質(zhì)過氧化，使MDA含量下降。

2.3 腦組織勻漿中SOD活性的變化

假手術(shù)組大鼠腦組織勻漿中SOD含量為(30.1±6.36)U/mg pro，缺血/再灌注后SOD水平顯著下降，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。Epo組大鼠腦組織勻漿中SOD活性顯著升高，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.01)，陽性對照Nim組大鼠腦組織勻漿SOD含量顯著升高，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.01，表1)。提示在大鼠腦缺血/再灌注損傷后Epo可以升高SOD活性，說明Epo具有抗氧化損傷的能力，保護神經(jīng)細胞的完整性。

Tab.1 Effect of Epo on the content of NO andMDA，SOD activities and the cerebral water content in the medium of neural cells injured by ischemia/reperfusion(，n=8)

Tab.1 Effect of Epo on the content of NO andMDA，SOD activities and the cerebral water content in the medium of neural cells injured by ischemia/reperfusion(，n=8)

**P＜0.01 vs sham-operated;#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R

Group NO(μmol/L) MDA(nmol/mg pro) SOD(U/mg pro) Water(%)Sham-operated 1.89±0.39 23.3±5.4 30.1±6.36 77.8±3.2 I/R 7.20±1.74** 44.8±4.7** 15.3±3.11** 85.4±3.3**Epo 3.73±0.92## 35.2±5.5## 23.8±1.89## 82.1±3.0#Nim 3.18±0.84## 31.3±8.6## 25.4±4.03## 81.4±3.1#

2.4 腦組織含水量

正常腦組織含水量77.8%±3.2%，缺血/再灌注組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，Epo組腦組織含水量顯著下降，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.05)，陽性對照Nim組腦組織含水量顯著下降，與缺血/再灌注組相比有顯著性差異(P＜0.05，表1)，表明Epo能顯著減輕腦組織的水腫。

3 討論

近年來研究證實，正常腦組織和缺血腦組織中都有Epo及其受體表達上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)Epo具有一定的神經(jīng)保護作用，但其作用機制尚未完全明了，可能通過多種途徑減少缺血后神經(jīng)元的損傷[3]。

本實驗用NO濃度代表自由基的生成量，用MDA反應(yīng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，用SOD反應(yīng)機體組織抵抗脂質(zhì)過氧化的能力。結(jié)果顯示腦缺血/再灌注組NO濃度顯著增高，反映了腦缺血/再灌注后自由基的產(chǎn)生明顯增加，腹腔注射Epo后，NO濃度較缺血/再灌注組明顯降低，說明Epo減少自由基的生成。針對SOD活性和MDA濃度的統(tǒng)計分析同樣說明Epo的使用可以降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，可以提高機體的抗脂質(zhì)過氧化能力。本研究中，缺血/再灌注組腦組織含水量顯著升高，Epo組腦組織含水量較缺血/再灌注組顯著下降，說明Epo的應(yīng)用能顯著減少缺血區(qū)腦水腫的發(fā)生。

Epo在缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護機制比較復(fù)雜，可能包括:減少興奮性氨基酸神經(jīng)毒性作用，激活神經(jīng)元內(nèi)的抗氧化酶，抑制細胞凋亡，抑制NO的合成及抗自由基作用，增加神經(jīng)細胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，促進腦功能全面恢復(fù)，誘導(dǎo)缺血損傷區(qū)的血管再生，增加缺血半暗帶供血供氧，減輕缺血損傷后的炎癥反應(yīng)等[5]。本研究提示Epo保護神經(jīng)元的機制可能是Epo通過一定的通路使缺血/再灌注后自由基生成減少、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減輕、腦水腫減輕等，起到了對神經(jīng)細胞的保護作用。我們期望隨著研究的深入，Epo將作為一種安全有效的神經(jīng)保護劑應(yīng)用于腦血管病的治療。

[1]Hasselblatt M，Ehrenreich H，Siren A L.The brain erythropoietin system and its potential for therapeutic exploitation in brain disease[J].J Neurosurg Anesthesiol，2006，18(2):132-138.

[2]Kumral A，Genc S，Ozer E，et al.Erythropoietin downregulates bax and DP5 proapoptotic gene expression in neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J].Biol Neonate，2006，89(3):205-210.

[3]Gassmann M，Heinicke K，Soliz J，et al.Non-erythroid functions of erythropoietin[J].Adv Exp Med Biol，2003，543:323-330.

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[5]李中春，陳懷紅.促紅細胞生成素對缺血性腦損傷保護作用的研究進展[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2005，3(1):51-54.