粟米草皂甙對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討

熊建軍,龔 幀,吳周環(huán),林 玲,甘麗君,黃愛(ài)君,李雪芹

(九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西九江 332000)

研究證實(shí),血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)異常增殖是高血壓的重要病理變化。VSMCs異常增殖使血管壁增厚,順應(yīng)性下降,管腔狹窄,同時(shí)分泌眾多活性物質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)成分,促進(jìn)高血壓的病理過(guò)程。因此,抑制 VSMCs增殖是防治高血壓的重要途徑之一[1]。粟米草為番杏科植物,性味淡平,有清熱解毒、利濕功能,主治腹痛瀉泄、瘡疥腫毒等[2]。文獻(xiàn)報(bào)道,粟米草中提取的粟米草皂甙,具有抗心律失常、增加冠狀動(dòng)脈血流量、降低血壓等藥理作用[3],但其降壓機(jī)制尚不明確。2008年 10月 ～2009年 7月,我們觀察了粟米草皂甙對(duì) VSMCs增殖的影響,并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 粟米草皂甙,原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs(第 4～8代細(xì)胞),DMEM干粉,新生小牛血清,胰酶,青霉素,鏈霉素,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT),總 RNA提取試劑盒,一步法 RT-PCR試劑盒,β-actin及線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A(mtTFA)引物,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,酶標(biāo)儀,普通臺(tái)式離心機(jī),電熱恒溫水浴箱,PCR儀,凝膠成像系統(tǒng),超凈工作臺(tái),普通及低溫冰箱,普通及電子天平。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs增殖情況觀察 采用 MTT法。將VSMCs懸液以每孔 1×104個(gè)細(xì)胞接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后吸去原培養(yǎng)液,換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。實(shí)驗(yàn)組加入粟米草皂甙,使其終濃度分別為 1、3、9、27μmol/L(其中 DMSO終濃度不超過(guò) 0.1%)；對(duì)照組加等體積稀釋后的 DMSO。每組均設(shè) 4個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)不換液,分別培養(yǎng) 24、48、72 h。實(shí)驗(yàn)終止前加 MTT(5 mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后離心棄上清液,加 DMSO 150μl,振蕩 10 min,溶解結(jié)晶物。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上波長(zhǎng) 490 nm處測(cè)各孔吸光度值(A值),以空白對(duì)照調(diào)零,計(jì)算對(duì)細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-觀察組 A值 /空白組 A值)×100%。

1.2.2 VSMCs中 mtTFA mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。Trizol試劑提取 VSMCs總 RNA,分光光度計(jì)測(cè)總 RNA純度。采用一步法 RT-PCR試劑盒,按照說(shuō)明書操作,內(nèi)參照為 β-actin(475 bp)。反應(yīng)結(jié)束后,取 PCR反應(yīng)液 8μl進(jìn)行 1.4%的瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。以目的條帶值與β-actin條帶的平均光密度值比值表示 mtTFA mRNA表達(dá)量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS15.0軟件處理。組間顯著性檢驗(yàn)采用 t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較 見(jiàn)表1。由表可見(jiàn),在粟米草皂甙濃度為 3～27μmol/L范圍內(nèi),細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度呈明顯依賴關(guān)系；且在一定濃度范圍內(nèi),粟米草皂甙對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈時(shí)間依賴關(guān)系。

2.2 兩組 mtTFA mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。由表可見(jiàn),不同濃度粟米草皂甙作用后,VSMCs中 mt-TFA mRNA表達(dá)水平下降,隨濃度遞增下降更為明顯。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較(%,±s)

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較(%,±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01；與同組 24 h、72 h比較,△P＜0.05

組別 細(xì)胞增殖抑制率觀察組24 h 48 h 72 h 1μmol/L 20.3±4.6 23.9±6.4 28.6±5.6 3μmol/L 36.3±5.5* 48.0±5.8*△ 54.7±3.3*9μmol/L 44.8±4.5* 57.9±3.4#△ 66.8±4.6#27μmol/L 56.1±6.2# 60.2±5.0#△ 70.3±6.1#對(duì)照組 18.7±4.3 21.4±6.0 23.3±5.8

表2 兩組 mtTFA mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 兩組 mtTFA mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01

組別 mtTFA mRNA觀察組24 h 48 h 72 h 1μmol/L 0.58±0.11 0.46±0.13 0.41±0.05 3μmol/L 0.44±0.08 0.27±0.06* 0.22±0.04*9μmol/L 0.31±0.07 0.18±0.05# 0.13±0.03#27μmol/L 0.23±0.04 0.11±0.05# 0.08±0.02#對(duì)照組 0.61±0.09 0.45±0.11 0.43±0.07

3 討論

粟米草為番杏科植物,包括星粟米草屬和粟米草屬,有清熱解毒、利濕等功能,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是黃酮類和甾體類化學(xué)成分。我們的前期研究表明,非細(xì)胞毒劑量的粟米草提取物對(duì)高血壓大鼠有明顯的降壓效果,但是其作用機(jī)制尚不明確。

在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病中,VSMCs異常增殖是重要的病理變化,抑制 VSMCs增殖與遷移可逆轉(zhuǎn)血管構(gòu)型,提高動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等患者的生存率及生存質(zhì)量。目前,臨床上只有少數(shù)藥物如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等有類似療效。本研究結(jié)果顯示,不同濃度粟米草皂甙作用后均可抑制 VSMCs增殖,并且這種抑制作用隨著粟米草皂甙濃度增高而增強(qiáng)。這表明粟米草皂甙可有效抑制 VSMCs增殖,為闡明粟米草抗高血壓的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

在體外培養(yǎng)中,血清對(duì) VSMC增殖受細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,其中涉及多條通路。我們研究發(fā)現(xiàn),粟米草皂甙抑制 VSMCs的增殖與 mtTFA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。已知 mtTFA是由核基因組編碼,在胞質(zhì)內(nèi)合成后再進(jìn)入線粒體的蛋白分子,對(duì)線粒體增殖和功能起重要調(diào)控作用[4]。mtTFA從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體,作用于 mtDNA啟動(dòng)基因,在線粒體 RNA聚合酶作用下,通過(guò)調(diào)節(jié) mtDNA輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)錄而控制 mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。因此,mtTFA是決定線粒體數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵分子,對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響[5]。國(guó)外研究已證明,通過(guò)反義技術(shù)干預(yù) mtTFA能顯著抑制平滑肌細(xì)胞的增殖[6]。本研究結(jié)果顯示,粟米草皂甙能抑制血清對(duì)mtTFA mRNA的表達(dá),提示粟米草皂甙可能通過(guò)抑制 mtTFA mRNA高表達(dá)發(fā)揮抑制VSMCs增殖作用。已知 mtTFA表達(dá)受控于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,多種胞外信號(hào)如葡萄糖、LPS等可導(dǎo)致其啟動(dòng)子的激活[7,8],引起蛋白表達(dá)升高。mtTFA啟動(dòng)子的激活依賴于核呼吸因子 1和 2(NRF-1、NRF-2)[9],同時(shí)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ輔激活因子-1(PGC-1)對(duì)NRF-1、NRF-2和 mtTFA等基因表達(dá)產(chǎn)生強(qiáng)大的誘導(dǎo)作用[10]。粟米草皂甙中的黃酮類和甾體類化學(xué)成分有可能在多個(gè)環(huán)節(jié)抑制 mtTFA的轉(zhuǎn)錄,從而抑制了 mtTFA蛋白的表達(dá),最終導(dǎo)致線粒體功能改變,細(xì)胞增殖減少,其具體機(jī)制有待深入研究。

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