通脈大生片對(duì)排卵障礙型不孕大鼠FSH、LH、TGF-β1的影響研究

通脈大生片是成都中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院用于婦科臨床50余年的院內(nèi)制劑，來(lái)源于著名中醫(yī)學(xué)家卓雨農(nóng)老先生自制方“通脈大生丸”，在腎虛、沖任虛損所致的排卵障礙、黃體功能不健的不孕癥等方面取得較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)主要研究通脈大生片對(duì)排卵障礙型不孕大鼠血清的FSH、LH及TGF-β1含量的影響，進(jìn)一步明確其治療腎虛、沖任虛損所致的排卵障礙、黃體功能不健的不孕癥作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康9日齡SD系雌性大鼠，出生后母鼠哺乳至22 日齡斷奶，專人飼養(yǎng)。利用自然光照，室溫維持在20～25 ℃，動(dòng)物和飼料均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SD大鼠批號(hào)為：SCXK(川)2008-11。

1.1.2 試劑及儀器 丙酸睪丸酮注射液，規(guī)格：25 mg∶1 ml，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0707031；通脈大生片，規(guī)格：0.3 g/粒，成都中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑，批號(hào)：090324；枸櫞酸氯米芬片，規(guī)格：50 mg/片，批號(hào)：A1102，Codal Synto Limited,Cyprus/賽普路斯企業(yè)生產(chǎn)；大鼠促卵泡素(FSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，批號(hào)：DEZ30597，由RD公司提供；大鼠促黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，批號(hào)：DEZ30623，由RD公司提供；大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，批號(hào)：DEZ30636，由RD公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表，將66只9日齡SD雌性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，通脈大生片高劑量組，通脈大生片中劑量組，通脈大生片低劑量組，氯米芬片對(duì)照組，共6組。參照俞瑾等[1]研究方法，于實(shí)驗(yàn)組和模型組頸背部皮下注射丙酸睪丸酮1.25 mg/只(0.05 ml/只)。正常組在同等條件下飼養(yǎng)，未作特殊處理。第22日齡斷奶，利用自然光照，室溫維持在20℃左右，并由專人在同樣條件飼養(yǎng)。第70日齡(大鼠體重約150 g左右) 陰道開口。連續(xù)陰道涂片2個(gè)性周期(1個(gè)性周期為5天)，觀察其陰道上皮細(xì)胞有無(wú)性周期變化，陰道上皮無(wú)性周期變化，則提示無(wú)排卵大鼠模型制作成功。

1.2.2 給藥方法 從第80天開始，各組分別按如下方法給藥，按臨床用藥，以60 kg 人為標(biāo)準(zhǔn)，按照體重—?jiǎng)┝繐Q算法計(jì)算大鼠給藥劑量，低劑量、中劑量、高劑量一次為人的5倍、10倍、20倍換算。模型組和正常組給1 ml (100g·d)生理鹽水灌胃；通脈大生片高劑量組給予0.12 g /ml(100g·d) 灌胃；通脈大生片中劑量組給予0.06 g /ml(100g·d) 灌胃；通脈大生片低劑量組給予0.03 g/ml(100g·d) 灌胃；氯米芬片組給予0.83 mg/ml(100g·d) 灌胃，每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃5周后股動(dòng)脈取血處死大鼠。

1.2.3 檢測(cè)方法 陰道脫落細(xì)胞檢查：大鼠第70日齡，每日清晨將蘸有生理鹽水的無(wú)菌棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，并緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，慢慢的將棉簽抽出，將棉簽上的粘液均勻的涂布于載玻片上，待涂片自然晾干后，用95%乙醇固定l5～30分鐘后取出，采用巴氏染色法，在顯微鏡下觀察并判定其性周期，連續(xù)兩個(gè)性周期，以判定造模的成功與否；連續(xù)灌胃5周后，股動(dòng)脈取血并處死大鼠，取出的血在室溫下靜置兩小時(shí)后，用轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘取上清液，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中FSH、LH和TGFβ-1的濃度，取出卵巢組織，小心的剔除脂肪組織，用10%甲醛固定，包埋、切片、HE染色，在100倍光鏡下觀察其病理形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)卵巢的病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

鏡下模型組卵巢蒼白，表面見大量的病理性囊性卵泡，較多閉鎖卵泡和原始卵泡存在，無(wú)成熟卵泡，卵泡較小，卵泡內(nèi)含大量漿液性物質(zhì)，卵泡壁顆粒細(xì)胞排列稀疏，層次明顯減少，間質(zhì)過(guò)度增生，無(wú)黃體生成；給藥組大鼠卵巢色澤較模型組鮮紅，卵泡較模型組增大，病理性囊性卵泡減少，卵泡壁顆粒細(xì)胞排列較密，層次增加，有成熟卵泡，有少量黃體生成；正常組大鼠卵巢色澤紅潤(rùn)，卵泡發(fā)育良好，成熟卵泡較多，表面見較多黃體。

2.2 各組間FSH、LH水平比較

各組間FSH水平比較見表1。模型組與正常組比較P<0.01，差異有顯著性。通脈大生片高劑量組FSH水平高于模型組，P<0.05，差異有顯著性。模型組與通脈大生片中、低劑量組比較均P>0.05，差異無(wú)顯著性。模型組與氯米芬片組比較，P<0.05，差異有顯著性。通脈大生片高劑量組FSH水平高于中、低劑量組，P<0.05，差異有顯著性。通脈大生片高劑量組與氯米芬片組比較P>0.05，無(wú)顯著差異。

各組間LH水平比較見表1。模型組與正常組比較P<0.01，差異有顯著性。模型組與氯米芬片組比較，P<0.01，差異有顯著性。通脈大生片高、中、低劑量組LH水平均高于模型組，P<0.01，差異有顯著性。通脈大生片各組與氯米芬組比較，均P>0.05，無(wú)顯著差異。通脈大生片高劑量組與正常組比較P<0.01，差異有顯著性。

表1 各組間FSH、LH水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

2.3 各組間TGF-β1水平比較

各組間TGF-β1水平比較見表2。模型組與正常組比較P<0.01。通脈大生片高劑量組TGF-β1水平高于模型組，P<0.01，差異有顯著性。

表2 各組間TGF-β1水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

3 討論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)卵巢排卵既受下丘腦—垂體—卵巢軸的調(diào)控，也受卵巢局部微環(huán)境特別是非固醇網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，即卵巢的自分泌—旁分泌系統(tǒng)在卵巢局部發(fā)揮微調(diào)節(jié)作用。中醫(yī)藥在腎主生殖理論指導(dǎo)下，用補(bǔ)腎為主的中藥治療不孕癥在臨床上具有特殊的優(yōu)勢(shì)。已有相關(guān)研究補(bǔ)腎中藥能夠調(diào)節(jié)性腺軸而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，但對(duì)卵巢局部調(diào)控研究機(jī)制尚不明確。

3.1 對(duì)FSH、LH的影響

FSH是一種糖蛋白激素，是卵泡發(fā)育的啟動(dòng)因子[2]。若無(wú)FSH則卵泡發(fā)育不能超過(guò)竇周生長(zhǎng)階段，卵泡不發(fā)育，E2水平低，生殖器官的生長(zhǎng)和促性腺激素的分泌負(fù)反饋受影響[2-3]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH水平，模型組與正常組比較，P<0.01，表明造模后大鼠血清內(nèi)FSH濃度明顯降低。模型組與氯米芬片組比較，P<0.05，F(xiàn)SH顯著升高。通脈大生片高劑量組與模型組比較，P<0.05，差異顯著，表明通脈大生片可以升高大鼠血清內(nèi)FSH水平，卵巢病理形態(tài)學(xué)表明經(jīng)通脈大生片治療后顆粒細(xì)胞增多，層次增加。由此可見，通脈大生片治療排卵障礙，其促排卵的作用機(jī)制之一為促使FSH水平的分泌，通脈大生片高劑量組升高FSH的作用與促排卵公認(rèn)的氯米芬片陽(yáng)性對(duì)照藥物極為相似，并不亞于氯米芬片(P>0.05)。

LH的主要生理功能是刺激卵泡膜細(xì)胞17α羥化酶活性,由膽固醇和孕烯醇酮合成的雄激素在顆粒細(xì)胞中擴(kuò)散,通過(guò)芳香化酶激活轉(zhuǎn)變成雌激素。LH可協(xié)同卵泡發(fā)育晚期的FSH起作用，還可刺激優(yōu)勢(shì)卵泡顆粒細(xì)胞上的孕激素受體的表達(dá)[2]。在本研究中，正常組與模型組比較差異均顯著，P<0.05,表明通過(guò)注射睪酮后，模型組LH水平明顯下降，但是經(jīng)過(guò)治療后，各給藥組LH水平與模型組比較，均明顯上升(P<0.01)，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與FSH恰恰相反，通脈大生片對(duì)于模型大鼠血清內(nèi)LH水平來(lái)說(shuō)，中低劑量更能明顯的升高LH水平，尤以低劑量組更顯著，其值接近正常值水平(P>0.05)，且與陽(yáng)性對(duì)照藥物氯米芬片之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而高劑量組雖然與模型組有差異(P<0.01)，但是卻與正常組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明通脈大生片高劑量組雖然能升高LH，但尚未達(dá)到正常范圍。由此可見，通脈大生片低劑量組在升高LH方面優(yōu)于其他治療組。

3.2 對(duì)TGF-β1的影響

TGF-β是一類具有多種生物活性的細(xì)胞因子，TGF-β1 促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)和分化[4]。TGF-β1 可提高顆粒細(xì)胞對(duì)低劑量FSH 刺激的敏感性[5]，而FSH 是卵泡發(fā)育成熟的主要啟動(dòng)因子[10]，卵巢局部TGF-β1 適當(dāng)?shù)谋磉_(dá), 促進(jìn)卵泡發(fā)育、黃體的形成，而其水平異常也會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常和排卵障礙[4-6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清中TGF-β1與正常組比較明顯下降，差異顯著(P<0.01)，表明造模后血清中TGF-β1降低，經(jīng)過(guò)治療后，各組TGF-β1均比模型組升高(P<0.05)，通脈大生片高、中劑量組升高TGF-β1接近正常值水平(P>0.05)，且中高劑量與氯米芬片組升高TGF-β1的程度相當(dāng)。有研究發(fā)現(xiàn)外源性因素刺激促使卵泡產(chǎn)生TGF-β1增強(qiáng)，引起卵巢間質(zhì)纖維化的發(fā)生[7]。TGF-β1在卵巢局部是通過(guò)其受體發(fā)揮生物學(xué)作用，本研究結(jié)果提示大鼠血清低TGF-β1水平與卵巢局部TGF-β1受體高表達(dá)有可能是導(dǎo)致排卵障礙的途徑之一，這將需要進(jìn)一步研究方能明確。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為腎藏精，主生長(zhǎng)發(fā)育，為生殖之本，內(nèi)寓真陰真陽(yáng)，腎氣盛，天癸至，沖任通盛，則月經(jīng)如期，孕育正常，即腎-天癸-沖任-胞宮軸在女性生殖系統(tǒng)中起著主導(dǎo)作用。卵子屬“生殖之精”的范疇，先天生殖之精藏于腎，腎精滋長(zhǎng)是卵子發(fā)育成熟的基礎(chǔ)，充盛的腎精是實(shí)現(xiàn)排卵的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎精虧虛，卵子缺乏物質(zhì)基礎(chǔ)而不能成熟。而卵子的正常排出有賴于腎陽(yáng)鼓動(dòng)，“腎者主蟄，司開合”，陽(yáng)主乎動(dòng)，腎陽(yáng)作為內(nèi)在動(dòng)力鼓動(dòng)成熟卵子排出。沖為血海，任主胞胎，經(jīng)云：“任脈通, 太沖脈盛, 月事以時(shí)下, 故有子”，沖任流通, 氣血暢達(dá), 卵子才能順利排出。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，均會(huì)導(dǎo)致排卵功能障礙而致不孕。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)下丘腦—垂體—卵巢軸極為相似。辛明蔚[8]同樣認(rèn)為目前，卵泡發(fā)育不良性不孕癥病因病機(jī)比較明確，即以腎虛為主，又與肝郁、脾虛、沖任氣血失調(diào)密切相關(guān)，治療總以補(bǔ)腎為主，輔以疏肝、健脾、養(yǎng)血活血調(diào)沖任。

通脈大生片是由杜仲、續(xù)斷、桑寄生、肉蓯蓉、紫河車、茯苓、山藥、枸杞、首烏、臺(tái)烏、當(dāng)歸、荔枝核、車前仁等十七味中藥組成，方中用紫河車、肉蓯蓉、杜仲、續(xù)斷溫補(bǔ)腎陽(yáng)，血肉有情之品直入下焦，填奇經(jīng)之精，補(bǔ)奇經(jīng)之氣；配以枸杞子、首烏、當(dāng)歸養(yǎng)肝陰，補(bǔ)益奇經(jīng)之血；輔以山藥、茯苓、車前仁、桑寄生健脾利濕，調(diào)理脾胃，當(dāng)歸、臺(tái)烏、荔枝核活血行氣，通其脈絡(luò)，共湊通補(bǔ)之效。全方具有溫腎填沖，調(diào)補(bǔ)氣血，通暢脈絡(luò)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)通脈大生片可以升高大鼠血清FSH，LH，其升高FSH作用尤以高劑量組明顯，升高LH以通脈大生片低劑量組更為明顯。由于FSH，LH由腦內(nèi)垂體分泌，故可認(rèn)為通脈大生片可以提高垂體的內(nèi)分泌功能；同樣，通脈大生片可以升高大鼠血清內(nèi)TGF-β1水平，以高劑量組較為明顯，其導(dǎo)致該效應(yīng)的機(jī)理，尚需進(jìn)一步探討。

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