RP-HPLC法同時測定巴戟天中4種蒽醌類化合物的含量

鮑蕾蕾，吳巖斌，秦路平，卞俊，張巧艷#

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室，上海市 200433；2.解放軍第411醫(yī)院，上海市 200434；3.福建中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州市 350108）

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的根，是我國傳統(tǒng)中藥，分布于廣東、福建、廣西、海南、江西等省區(qū)，具有補腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，用于治療陽痿遺精、宮冷不孕、風(fēng)濕痹痛等證[1]。現(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明，巴戟天含有葸醌類、環(huán)烯醚萜苷和多糖等化學(xué)成分，具有增強(qiáng)免疫、抗抑郁、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用[2]。有文獻(xiàn)報道[3]，巴戟天的野生藥材、栽培藥材及栽培藥材不同農(nóng)家類型的種質(zhì)資源存在較大的變異，使其活性成分的組成和含量發(fā)生了變化，造成其藥材品質(zhì)存在較大差異，從而影響臨床用藥的安全、有效。鑒于此，筆者采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時測定巴戟天中4種蒽醌類化合物的含量，以為巴戟天藥材的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1200系列HPLC儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器（DAD）、柱溫箱、真空脫氣機(jī)、Chemstation 10.2工作站（美國Agilent公司）；BP211D型十萬分之一天平（德國Sartorius公司）。

磷酸（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、2-羥基-1-甲氧基蒽醌和2-羥基-3-羥甲基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品均為第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室自制，經(jīng)HPLC-DAD檢測純度均＞98%；巴戟天藥材商品分別于2009年6月購自廣東肇慶、德慶、清遠(yuǎn)三地，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室張巧艷副教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：0.2%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫（梯度洗脫時間見表1）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：277 nm。以甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、2-羥基-1-甲氧基蒽醌和2-羥基-3-羥甲基蒽醌計算，理論塔板數(shù)均應(yīng)＞5000；4種標(biāo)準(zhǔn)品的分離度均＞1.5。色譜見圖1。

表1 梯度洗脫時間Tab 1 Timetable of gradient elution

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素、2-羥基-1-甲氧基蒽醌和2-羥基-3-羥甲基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加入起始流動相至刻度，搖勻，制備成每1 mL含有20μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取巴戟天藥材，22～25℃自然風(fēng)干，粉碎后過2號篩，精密稱取藥材粉末2.0008 g，置250 mL燒瓶中，加入100 mL 95%乙醇，稱重，回流提取2次，每次2 h，放置至室溫，用95%乙醇補足失重，離心后定容至5 mL，并通過0.45 μm濾膜，濾液置于棕色樣品瓶中，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加甲醇稀釋成0.1、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0、250.0、500.0 μg·mL-1不同濃度，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

表2 4種蒽醌類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 2 Standard curves of 4 kinds of anthraquinones

2.4.2 精密度試驗 取同一份混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，2-羥基-3-羥甲基蒽醌、2-羥基-1-甲氧基蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素峰面積的RSD分別為0.61%、0.60%、0.78%和0.54%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液20 μL，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，2-羥基-3-羥甲基蒽醌、2-羥基-1-甲氧基蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素峰面積的RSD分別為0.72%、0.90%、1.02%、1.04%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品藥材2 g，共6份，精密稱定，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，各取20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法測定含量。結(jié)果，2-羥基-3-羥甲基蒽醌、2-羥基-1-甲氧基蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素的平均含量分別為94.3557、164.4324、80.2636、21.5345 μg·g-1，RSD分別為1.76%、2.51%、1.09%、1.57%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的藥材粉末約2 g，共6份，分別精密加入4種標(biāo)準(zhǔn)品適量，按“2.3”項下方法提取樣品并測定含量，計算加樣回收率。結(jié)果，2-羥基-3-羥甲基蒽醌、2-羥基-1-甲氧基蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素的平均回收率分別為98.69%、99.67%、97.91%、99.74%，RSD分別為0.90%、1.97%、1.14%、0.41%（n＝6）。

2.5 3批不同產(chǎn)地巴戟天中蒽醌類成分的含量測定結(jié)果

稱取3批不同產(chǎn)地的巴戟天藥材粉末各2 g，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計算供試品溶液中的4種蒽醌類化合物的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中4種蒽醌類化合物的含量測定結(jié)果（μg·g-1，n＝3）Tab 3 Content determination of 4 kinds of anthraquinones in samples（μg·g-1，n＝3）

3 討論

在選擇流動相時，主要考察了甲醇-水和乙腈-水兩元系統(tǒng)。由于巴戟天蒽醌多數(shù)為苷元，呈弱酸性，所以分別考慮在水中添加酸試劑得到0.1%甲酸、0.1%醋酸和0.2%磷酸水溶液進(jìn)一步進(jìn)行流動相篩選。結(jié)果表明，以乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫的分離效果較好，故選擇了乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相。

在進(jìn)行柱溫選擇時，考察了柱溫為15、20、25、30、35、40 ℃對色譜分離效果的影響。結(jié)果表明，柱溫對保留時間在20 min以后的色譜峰的分離有明顯的影響：柱溫從15℃變化至40℃，色譜峰均前移，保留時間縮短，只有在30℃時最為合適，各峰的分離度符合要求。因此，選定柱溫為30℃。

在考察提取溶劑時，筆者分別用95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、95%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙酸乙酯、氯仿和丙酮對巴戟天進(jìn)行超聲提取和回流提取，根據(jù)“2.1”項下色譜條件對其進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯、氯仿和丙酮對樣品的提取適用于HPLC分析，但提取不夠完全，得到的峰數(shù)少且峰面積較??；75%乙醇、50%乙醇、75%甲醇、50%甲醇提取較完全，但提出蒽醌量較低；95%乙醇和95%甲醇對樣品提取較完全且雜質(zhì)相對較少，且95%乙醇較95%甲醇提取效果稍好；而回流提取效果優(yōu)于超聲提取。在回流提取的條件下，筆者相應(yīng)考察了提取時間，發(fā)現(xiàn)回流提取2次，每次2 h基本可以提取完全。因此，最終確定樣品采用95%乙醇回流提取2次，每次2 h。

巴戟天藥材由于不同農(nóng)家種植資源類型及生長環(huán)境的影響，其活性成分的組成和含量常存在較大的差異，會直接影響該藥材的品質(zhì)和質(zhì)量。蒽醌類化合物是巴戟天的主要化學(xué)活性成分，故對其建立方便、快速的檢測方法來控制巴戟天的質(zhì)量非常必要。本試驗方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于巴戟天藥材中4種蒽醌類化合物的含量測定。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：45.

[2]楊黎輝，閏福曼，陳朝鳳.中藥巴戟天提取物藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2005，33（2）：6.

[3]丁 平，徐吉銀，楚桐麗.巴戟天不同農(nóng)家類型種質(zhì)資源的RAPD分析[J].中藥材，2006，29（1）：1.