HPLC法同時(shí)測定黃芪中4種黃酮類成分的含量Δ

梁麗娟，趙奎君，屠鵬飛，姜勇

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京市 100050；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，北京市 100083）

2005年版《中國藥典》收載的黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge或蒙古黃芪A.membranaceus var.mongholicus（Bunge）Hsiao的干燥根。黃芪是傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，有補(bǔ)氣升陽、益胃固表、利水消腫、脫毒生肌等功效。黃芪的主要化學(xué)成分為黃酮類和三萜皂苷[1]，其中黃酮類是黃芪的有效成分之一。為探討黃芪道地性與其活性成分的內(nèi)在聯(lián)系，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對黃芪中含量較大的4種黃酮類成分進(jìn)行測定，以為黃芪多指標(biāo)質(zhì)量控制方法的建立提供科學(xué)、可靠的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1100型HPLC系統(tǒng)（美國Agilent公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

乙腈（色譜純，天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；無水甲酸（分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為重蒸水；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品均由北京大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心自制，經(jīng)HPLC檢測純度均＞98%；所用藥材采集于相應(yīng)的產(chǎn)地，經(jīng)筆者鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bunge var.mongholicus（Bunge）Hsi-ao的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），KJO-4282 Phenomenex預(yù)柱；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.2%甲酸），梯度洗脫（梯度見表1）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。色譜見圖1。

2.2 混標(biāo)溶液的制備

分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加50%甲醇-水制成質(zhì)量濃度約為0.5 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得4種黃酮類成分的混標(biāo)貯備液A；取貯備液A 0.5 mL，定容至5 mL，制成貯備液B；取貯備液B 0.5 mL，定容至5 mL，制成混標(biāo)溶液C。

表1 流動(dòng)相的梯度Tab 1 Gradient of mobile phase

2.3 供試品溶液的制備

取黃芪藥材粉末（過60目篩，50℃低溫烘干12 h）1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加40 mL甲醇回流提取3.5 h，提取液減壓濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并定容至5 mL，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取上述貯備液A10 μL，貯備液B10、20、30、40、50 μL，混標(biāo)溶液C10、50 μL，注入液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及其線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 4種黃酮類成分的線性回歸結(jié)果Tab 2 Results of linear regression of 4 kinds of flavonoids

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混標(biāo)溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，按4種黃酮類成分的峰面積積分值分別計(jì)算其RSD值。結(jié)果，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的RSD分別為0.32%、0.31%、0.33%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣檢測，按4種黃酮類成分的峰面積積分值分別計(jì)算其RSD值。結(jié)果，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的RSD分別為1.2%、0.79%、0.49%、0.21%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地藥材，精密稱取樣品6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法測定。結(jié)果，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均含量（mg·g-1）和RSD分別為0.312、3.9%，0.143、3.7%，0.160、2.8%，0.095、4.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的同一批樣品6份，每份約1.0 g，精密加入混標(biāo)貯備液A 0.5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法測定。結(jié)果，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均回收率和RSD分別為99.6%、2.80%，99.8%、1.41%，100.3%、2.51%，101.4%、1.67%（n＝6）。

2.9 不同產(chǎn)地樣品中4種黃酮類成分的含量測定

精密稱取每個(gè)產(chǎn)地5批樣品，每份約1.0 g，照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地藥材中4種黃酮類成分的含量測定結(jié)果（mg·g-1，n＝5）Tab 3 Contents of 4 flavonoids in different cultivated regions（mg·g-1，n＝5）

3 討論

本試驗(yàn)前期工作曾對提取溶劑（甲醇、70%甲醇-水、乙醇和水）、提取方式（超聲提取、回流提取和索氏提?。┮约疤崛r(shí)間（1、2、2.5、3、3.5、4 h）進(jìn)行過考察。結(jié)果表明，采用純甲醇回流提取3.5 h時(shí)4種黃酮類成分的峰面積均達(dá)到最大值。

在色譜柱選擇方面，試驗(yàn)分別比較了Kromasil 100 ? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zobax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。結(jié)果表明，Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離度最好。

由含量測定結(jié)果可以看出，內(nèi)蒙古、山西4個(gè)產(chǎn)地的黃芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷的含量較高；河北安國、赤城和甘肅定西產(chǎn)黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量較高；四川產(chǎn)黃芪中4種黃酮類成分含量均很低。

南北朝《名醫(yī)別錄》記載黃芪的最早產(chǎn)地為四川、甘肅和陜西省毗鄰地區(qū)；唐《新修本草》中黃芪的產(chǎn)地向東北移至陜西中部和寧夏南部地區(qū)；元《湯液本草》中黃芪產(chǎn)地又從陜西逐漸移至山西，最終穩(wěn)定在山西。清《植物名實(shí)圖考》載：“黃芪有數(shù)種，山西、蒙古者最佳?！泵駠蹶惾噬街摹端幬锍霎a(chǎn)辨》載：“正芪產(chǎn)區(qū)有三處：一關(guān)東，二寧古塔，三卜奎，產(chǎn)東三省，現(xiàn)時(shí)山西大同、忻州地區(qū)，內(nèi)蒙古及東北產(chǎn)者為優(yōu)?！笨梢?，黃芪道地產(chǎn)品從最初的甘肅、四川北部、陜西南部，逐漸過渡至以山西、內(nèi)蒙古地區(qū)的蒙古黃芪為主的趨向。本試驗(yàn)結(jié)果與黃芪的本草考證、道地沿革的文獻(xiàn)基本相符。

有關(guān)黃芪中4種異黃酮含量的HPLC法同時(shí)測定曾有報(bào)道[2]，但主要是方法學(xué)的研究，所測定的藥材主要為商品藥材，沒有涉及黃芪的道地性。本試驗(yàn)主要是從有效成分含量探討藥材道地性的內(nèi)在因素，所測定的11批藥材均由產(chǎn)地采集，這些產(chǎn)地很好地反應(yīng)了黃芪道地性的歷史沿革。另外，本試驗(yàn)對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，選用0.2%的甲酸水為流動(dòng)相，改善了拖尾現(xiàn)象，使分離度更好；選用280 nm為檢測波長，減少了雜質(zhì)峰的干擾且靈敏度高。由于4種黃酮類成分極性差別較大，故溶解樣品時(shí)選用50%的甲醇使極性較大的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和極性較小的毛蕊異黃酮、芒柄花素都能很好的溶解。

對于黃芪的質(zhì)量控制，以往文獻(xiàn)也曾報(bào)道過毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和黃芪甲苷的含量測定[3]，但均是分開測定，操作煩瑣，而且僅以某一種成分的含量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制，并不能反映藥材的全貌。本試驗(yàn)建立了同時(shí)測定4種黃酮類成分含量的方法，簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于綜合評價(jià)藥材的質(zhì)量。

[1]肖培根.新編中藥志（第1卷）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：876.

[2]李小兵，謝曉梅，周銅水.高效液相色譜法同時(shí)測定黃芪中4種異黃酮的含量[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（5）：413.

[3]宋永熙，曲 婷，胡寶榮，等.復(fù)方黃芪膠囊的制備及質(zhì)量控制[J].中國藥房，2005，16（19）：1469.