黃瓜瓜長性狀的QTL定位分析

程周超 顧興芳 張圣平 苗 晗 張若緯 劉苗苗 楊雙娟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國的重要蔬菜作物，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的黃瓜品種是黃瓜育種者的共同目標(biāo)（顧興芳 等，2005）。近年來，分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種技術(shù)的應(yīng)用，極大地加速了育種進(jìn)程，然而這依賴于飽和的遺傳圖譜和準(zhǔn)確的性狀QTL定位（Tanksley et al.，1989）。由于黃瓜的遺傳基礎(chǔ)狹窄，自 1994年 Kennard將分子標(biāo)記技術(shù)用于遺傳圖譜的構(gòu)建到2009年第一張飽和SSR分子圖譜的完成（Ren et al.，2009）期間，構(gòu)建的主要黃瓜遺傳圖譜（Park et al.，2000；Bradeen et al.，2001；Fazio et al.，2003；Yuan et al.，2007）存在飽和度低、通用標(biāo)記少、連鎖群與染色體不對(duì)應(yīng)等缺點(diǎn)，第一張飽和SSR遺傳圖譜（Ren et al.，2009）雖然克服了上述缺點(diǎn)，但是沒有對(duì)黃瓜的農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL分析，因此不能將其直接應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

黃瓜果實(shí)長度是其重要的外觀品質(zhì)性狀。由于消費(fèi)習(xí)慣和用途的不同，各地對(duì)黃瓜長度的要求不一，因此，研究控制果實(shí)長度的基因，可以為黃瓜品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。前人對(duì)黃瓜瓜長的QTL進(jìn)行了一些研究（Kennard & Havey，1995；Serquen et al.，1997；Fazio et al.，2003；Yuan et al.，2007），這些報(bào)道中檢測到的瓜長QTL在4～6個(gè)之間，但由于所用試驗(yàn)材料不同，造成QTL數(shù)和位置也不同，同時(shí)缺少相同的錨定標(biāo)記，且已報(bào)道的QTL也沒有與相應(yīng)的染色體對(duì)應(yīng)，使得難于對(duì)不同圖譜間的QTL進(jìn)行準(zhǔn)確的比較。

本試驗(yàn)以黃瓜野生變種PI 183967和新泰密刺選系931雜交獲得的F2群體為作圖群體，構(gòu)建了一張黃瓜SSR遺傳圖譜，并對(duì)瓜長進(jìn)行了QTL定位分析，為黃瓜MAS育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及性狀調(diào)查

試驗(yàn)材料為黃瓜野生變種PI183967（來源于美國威斯康辛大學(xué)）、新泰密刺選系931（來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所）和以兩者為親本的F2、F3群體。

2008年秋分別將兩個(gè)親本和F2種植于本所溫室中，F(xiàn)2群體共包含179個(gè)單株；2009年春將179個(gè)F2：3家系及親本種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口實(shí)驗(yàn)基地溫室內(nèi)，每家系種植10株，均進(jìn)行常規(guī)栽培管理。當(dāng)果實(shí)長度達(dá)到商品瓜大小時(shí)測量瓜長，測量標(biāo)準(zhǔn)為正常商品瓜瓜蒂至瓜頂?shù)拈L度（李錫香 等，2005）。取F3各家系內(nèi)瓜長的平均值用于QTL分析。

1.2 遺傳分析

采用DPSv6.55數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)親本的瓜長數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，應(yīng)用Excel 2003檢驗(yàn)瓜長在F2群體及F2：3家系中的分布是否符合正態(tài)分布。

1.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

1.3.1 SSR引物的來源 本試驗(yàn)所用的SSR引物來源于黃瓜全基因組序列，共2112對(duì)（Ren et al.，2009）。

1.3.2 SSR分析 從親本和 F2群體 179個(gè)單株側(cè)枝上取葉片，冷凍處理后，用改良的 CTAB法（Clark，1998）提取基因組 DNA；SSR 反應(yīng)體系：總體積 15 μL，1.5 μL 10×PCR buffer，0.2 μL dNTP（2.5 mmol·μL-1），0.15 μL Taq 酶（5 U·μL-1），2 μL DNA（10ng·μL-1），正向、反向引物（50ng·μL-1）各1 μL，其余以ddH2O補(bǔ)足15 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫5 min；擴(kuò)增產(chǎn)物用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠160V恒功率電泳分離，銀染顯色后在觀察燈箱上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 標(biāo)記的選擇 本試驗(yàn)使用的 SSR標(biāo)記分兩部分進(jìn)行選擇：①將利用親本篩選的有多態(tài)性的標(biāo)記與黃瓜高密度圖譜（Ren et al.，2009）上的標(biāo)記進(jìn)行比較分析，從中挑選出條帶清晰、穩(wěn)定，而且沒有定位在高密度圖譜上的SSR標(biāo)記，全部用于分離群體的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建；②為了保證遺傳圖譜上標(biāo)記分布的均勻性，又從親本篩選出的有多態(tài)性的標(biāo)記中挑選出了一些標(biāo)記，這些標(biāo)記的選擇是根據(jù)它們?cè)邳S瓜染色體上的位置，以大約每5 cM的距離進(jìn)行挑選。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法及圖譜的構(gòu)建 共顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法：來自母本（PI183967）的帶型記為a，來自父本（931）的帶型記為b，雜合的帶型記為h，未擴(kuò)增出的或模糊不清的記為u。顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法：若 P1為顯性，則 F2單株中和 P1帶型一致的記為 d，和 P2帶型一致的記為 b；若P2為顯性，則 F2單株中和 P1帶型一致的記為 a，和 P2帶型一致的記為 c。最后利用 JoinMap3.0（van Ooijen & Voorrips，2001），LOD閾值3.0，分析數(shù)據(jù)獲得黃瓜遺傳圖譜。

1.4 QTL分析與命名

利用MapQTL 4.0分析軟件進(jìn)行QTL分析，首先以置換測驗(yàn)確定QTL存在的LOD閾值，然后利用區(qū)間作圖法（IM）進(jìn)行QTL分析，將最高LOD值所在位置的標(biāo)記或與其緊密連鎖的標(biāo)記作為協(xié)同因子，再對(duì)IM檢測到的QTL進(jìn)行多座位QTL模型（Multiple-QTL model，MQM）檢測，以連鎖群上 LOD值最高的位置作為 QTL的位置，以 2-LOD的區(qū)間作為 95 %的置信區(qū)間（van Ooijen，1992）。QTL的命名參照Yuan等（2007）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2遺傳圖譜的構(gòu)建

利用兩構(gòu)圖親本PI183967和931進(jìn)行多態(tài)性篩選，從2112對(duì)引物中，獲得996對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)率為47.2 %；從中挑選出319對(duì)SSR引物對(duì)F2群體進(jìn)行分析，排除群體分析中條帶模糊不清的標(biāo)記，最終得到238對(duì)可用標(biāo)記，建立了包含7個(gè)連鎖群，234個(gè)SSR標(biāo)記的黃瓜遺傳圖譜（圖1）。該圖譜覆蓋基因組長度829.7 cM，平均圖距3.5 cM。每個(gè)連鎖群的標(biāo)記數(shù)在 20～51之間，LG3包含的標(biāo)記數(shù)最多，有51個(gè)；LG7含有的標(biāo)記數(shù)最少，只有20個(gè)；連鎖群的長度在56.4～158.7 cM之間；圖譜密度在2.7～6.5 cM·maker-1之間，LG4的平均間距最小，為2.7 cM·marker-1；LG2的平均間距最大，為6.5 cM·maker-1。應(yīng)用MapInspect軟件對(duì)該圖譜和黃瓜高密度遺傳圖譜（Ren et al.，2009）進(jìn)行比較，7個(gè)連鎖群上共有86個(gè)標(biāo)記與高密度圖譜一致，本試驗(yàn)中的1～7個(gè)連鎖群中分別有17、12、17、5、9、16、10個(gè)標(biāo)記和高密度圖譜的1～7條染色體對(duì)應(yīng)，從而確定了本試驗(yàn)構(gòu)建的7個(gè)連鎖群和黃瓜7條染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系（表1）。

表1 黃瓜F2SSR遺傳圖譜

2.2 瓜長QTL分析

2.2.1 遺傳分析 差異顯著性分析結(jié)果顯示（表2），瓜長在兩親本間表現(xiàn)出極顯著差異，F(xiàn)2群體及F3的瓜長平均值分別為12.74和10.4。標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.75和2.24，均表現(xiàn)出明顯的分離。并且其分布為單峰分布，F(xiàn)2群體的峰值為0.23，偏度為-0.26，絕對(duì)值均小于 2，是數(shù)量性狀的典型特征；在F3群體中，峰值為1.25，偏度為 4.13，絕對(duì)值大于 2，說明對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的正態(tài)分布而言，該分布呈尖頂峰，但還是表現(xiàn)出明顯的單峰分布，因此基本符合正態(tài)分布，可用于數(shù)量性狀的定位分析（圖2、3）。

2.2.2 F2群體 QTL定位 用 MapQTL 4.0復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì) 2008年秋季 F2的瓜長進(jìn)行 QTL分析，共檢測到2個(gè)QTL（表3），將其命名為fl1.1和fl1.2，分別位于LG1（Chr1）的SSR02734～SSR05709之間和 LG4（Chr4）的SSR19596～SSR20063之間，fl1.1和fl1.2分別和標(biāo)記SSR05709和SSR20063更接近，這兩點(diǎn)的貢獻(xiàn)率分別為14.1 %和12.5 %；加性效應(yīng)為負(fù)，表現(xiàn)為減效加性效應(yīng)，說明這些位點(diǎn)上使果實(shí)長度偏短的效應(yīng)主要來自于黃瓜野生變種PI183967；這兩個(gè)QTL的顯性勢（顯性效應(yīng)和加性效應(yīng)比值的絕對(duì)值）分別為0.21和0.23，根據(jù)Stuber等（1987）提出的QTL作用方式的判別標(biāo)準(zhǔn)，fl1.1和fl1.2均為部分顯性效應(yīng)。

表2 黃瓜瓜長在親本間的顯著性分析及F2群體和F2:3家系的平均值

圖1 PI183967、新泰密刺931 F2連鎖圖譜及瓜長的QTL位點(diǎn)

圖2 瓜長在黃瓜F2群體的分布

圖3 瓜長在黃瓜F2:3家系的分布

2.2.3 F2:3家系QTL定位 用同樣的作圖方法對(duì)2009年春季F2:3家系的瓜長進(jìn)行QTL分析，共檢測到3個(gè)QTL（表3），將其命名為fl1.1、fl4.2和fl6.1，分別位于LG1（Chr1）的SSR03680～SSR19914之間、LG4（Chr4）的 SSR03820～SSR12180之間和 LG6（Chr6）的 SSR15516～SSR23284之間。其中，貢獻(xiàn)率分別為9.4 %、13.3 %和7.1 %，其中fl4.2的貢獻(xiàn)率最高，fl6.1的貢獻(xiàn)率最低；加性效應(yīng)均為負(fù)，表現(xiàn)為減效加性效應(yīng)，和F2檢測到的QTL的效應(yīng)相同，也說明了果實(shí)長度偏短的效應(yīng)主要來自于黃瓜野生變種 PI183967；fl1.1、fl4.2和 fl6.1的顯性勢分別為0.19、0.34和0.53，依據(jù)Stuber等（1987）提出的差別標(biāo)準(zhǔn)，fl1.1為加性效應(yīng)，fl4.2和fl6.1均為部分顯性效應(yīng)。

表3 黃瓜瓜長在F2群體及F2:3家系的QTL定位

3 討論

基于已經(jīng)構(gòu)建的黃瓜高密度遺傳圖譜（Ren et al.，2009），本試驗(yàn)有目的地選擇作圖標(biāo)記，構(gòu)建了SSR遺傳圖譜，該圖譜每個(gè)連鎖群上的標(biāo)記分布都很均勻，不存在較大的間隙，從而有利于進(jìn)一步的QTL定位；并且除了共有標(biāo)記外，在該圖譜上還有208對(duì)標(biāo)記沒有在高密度圖譜上得到定位，這也為今后的圖譜整合工作奠定了基礎(chǔ)；通過和高密度圖譜的比較，確立了連鎖群和染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量性狀位點(diǎn)和染色體的對(duì)應(yīng)，為分子標(biāo)記輔助育種提供了更直觀的依據(jù)。

不同的試驗(yàn)群體會(huì)造成QTL數(shù)和位置的不同（Dijkuizen & Staub，2002）。本試驗(yàn)中F2：3家系檢測到的瓜長QTL為3個(gè)，多于F2檢測到的2個(gè)，并且與Owens等（1985）、Lower和Edwards（1986）根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估計(jì)控制瓜長的基因數(shù)為4個(gè)的結(jié)論較為接近。fl1.2和fl1.1位置相鄰（≤3 cM），在兩個(gè)世代間能夠相互對(duì)應(yīng)，推測其可能為同一個(gè)QTL，只是由于受到環(huán)境的影響而導(dǎo)致了不同世代間相對(duì)位置的微小變化；LG4（Chr4）上的fl4.1和fl4.2相距較遠(yuǎn)，且F2：3家系在LG6（Chr6）上檢測了fl6.1，而 F2在該連鎖群上未檢測到瓜長 QTL，這種不同可能是由于兩個(gè)世代的環(huán)境條件（溫度、地域等）差異，存在基因型和環(huán)境的互作效應(yīng)而產(chǎn)生的。

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