固本健腦液改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的實(shí)驗(yàn)研究

袁 林,朱云峰,黃 瓊,胡玉萍,袁德培

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)(湖北 武漢 430065)

本研究的課題組曾報(bào)道用固本健腦液對輕度認(rèn)知障礙模型大鼠治療給藥,效果明顯[1]，本實(shí)驗(yàn)通過固本健腦液預(yù)防給藥，然后復(fù)制東莨菪堿所致記憶獲得障礙、亞硝酸鈉所致記憶鞏固障礙及40%乙醇所致記憶再現(xiàn)障礙小鼠模型，觀察固本健腦液對模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用，進(jìn)一步為其臨床防治輕度認(rèn)知障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1固本健腦液由恩施板黨、枸杞、茯苓、山楂、酸棗仁等組成。除板橋黨參由恩施市峰嵐板橋黨參有限公司提供外，其余藥材均購自湖北中醫(yī)藥大學(xué)專家門診部中藥房。按傳統(tǒng)煎法，用5倍于藥材的冷水浸泡藥材20 min，用武火煎至水沸，改用文火煎煮40 min，濾過藥液后加冷水適量，復(fù)煎至水沸，改用文火煎30 min，濾出藥液，兩煎合兌，濃縮為每毫升含1 g生藥(即成人用藥劑量60 kg體重的等效劑量)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2動物選用清潔級昆明種小鼠90只，雄性，體重(20±2)g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3試劑東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號為20100110),乙醇(國產(chǎn)分析純，批號為20090401),亞硝酸鈉(國產(chǎn)分析純，批號為20090306)。

1.4動物分組和給藥小鼠隨機(jī)分成3組，每組再分為3個亞組，即正常組(A組)30只，其中A1、A2、A3每組各10只；固本健腦液組(B組)30只，其中B1、B2、B3每組各10只；模型組(C組)30只，其中C1、C2、C3各10只。各組小鼠均每日1次按10 ml/(kg·d)的劑量灌胃，正常組和模型組小鼠灌服生理鹽水，固本健腦液組灌服含生藥1 g/ml的固本健腦液，共10 d。

1.5 復(fù)制動物模型

1.5.1 小鼠記憶獲得障礙模型：取A1、B1、C1組于末次給藥1 h后進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練前20 min，B1組和C1組分別腹腔注射東莨菪堿3 mg/kg，A1組腹腔注射等容量生理鹽水。24 h后重新測試。

1.5.2 小鼠記憶鞏固障礙模型：取A2、B2、C2組于末次給藥1 h后進(jìn)行訓(xùn)練，B2組和C2組訓(xùn)練結(jié)束后立即分別皮下注射亞硝酸鈉120 mg/kg，A2組皮下注射等容量生理鹽水。24 h后進(jìn)行測試。

1.5.3 小鼠記憶再現(xiàn)障礙模型：取A3、B3、C3組于末次給藥1 h后進(jìn)行訓(xùn)練，24 h后重新測試。測試前20 min B3組和C3組分別以0.1 ml/10 g體重腹腔注射40%乙醇，A3組腹腔注射等容量生理鹽水。

1.6 跳臺法：訓(xùn)練時(shí)先將小鼠放入跳臺儀的5個格子內(nèi)適應(yīng)1 min，然后通36 V的交流電，小鼠受電擊后只有跳上跳臺才能逃避電擊，如跳下就會又受到電擊，如此訓(xùn)練5 min，記錄其跳下平臺受到電擊的次數(shù)作為錯誤次數(shù)；測試時(shí)先將小鼠放在跳臺上，同時(shí)秒表計(jì)時(shí)，記錄第一次跳下時(shí)間作為潛伏期；并記錄5 min內(nèi)跳下平臺受到電擊的錯誤次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1固本健腦液對記憶獲得障礙模型的影響由表1可見，在訓(xùn)練與測試過程中，C1組與A1組相比，錯誤次數(shù)增加而潛伏期縮短，兩項(xiàng)均有顯著差異 (P<0.01)；B1組與C1組相比，錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)，且潛伏期明顯延長(P<0.05)。

2.2固本健腦液對記憶鞏固障礙模型的影響由表2可見，在訓(xùn)練時(shí)，A1組和C1組兩組訓(xùn)練成績相比較無明顯差異(P>0.05)；B1組訓(xùn)練成績稍好于A1組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在測試時(shí)，C1組與A1組的測試成績相比，錯誤次數(shù)顯著增多(P<0.01)、潛伏期明顯縮短 (P<0.01)；B1組與C1組的測試成績相比，錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)，潛伏期明顯延長(P<0.05)。

表1 固本健腦液對記憶獲得障礙小鼠模型的影響

表2 固本健腦液對記憶鞏固障礙小鼠模型的影響

2.3固本健腦液對記憶再現(xiàn)障礙模型的影響由表3可以看出，在訓(xùn)練時(shí)，A1組和C1組兩組訓(xùn)練成績無明顯差異(P>0.05)；B1組訓(xùn)練成績比A1組稍優(yōu)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在測試時(shí)，C1組與A1組的測試成績相比，錯誤次數(shù)顯著增多(P<0.01)而潛伏期明顯縮短 (P<0.01)；B1組的測試成績明顯好于C1組，表現(xiàn)在錯誤次數(shù)減少 (P<0.05)、潛伏期延長(P<0.05)。

表3 固本健腦液對記憶再現(xiàn)障礙小鼠模型的影響

3 討論

學(xué)習(xí)和記憶分為三個階段，即學(xué)習(xí)記憶的獲得、記憶的鞏固和記憶的再現(xiàn)[2]。文獻(xiàn)記載東莨菪堿、亞硝酸鈉、乙醇可分別對此三個階段進(jìn)行阻斷，用這三種化學(xué)試劑造模，具有記憶損害確實(shí)、損害環(huán)節(jié)明確、造模方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，故常用于制造學(xué)習(xí)記憶功能障礙的動物模型[3]。跳臺法屬于被動回避性反射法，可以考察藥物對記憶全過程的影響，同時(shí)測定藥物對逃避潛伏期和安全平臺潛伏期的影響，可以排除藥物非特異性作用的干擾[4]。因此本實(shí)驗(yàn)用跳臺法觀察固本健腦液對記憶獲得、鞏固和再現(xiàn)障礙動物模型的影響。

東莨菪堿為M—膽堿能受體阻滯劑，訓(xùn)練前20 min腹腔注射可抑制條件反射的形成，破壞動物記憶的獲得[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示訓(xùn)練和測試過程中，模型組與正常組均存在顯著差異，提示學(xué)習(xí)記憶獲得障礙模型復(fù)制成功。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示固本健腦液組的成績明顯優(yōu)于模型組，表明固本健腦液預(yù)防給藥可明顯改善動物的記憶獲得性障礙。

訓(xùn)練后腹腔注射亞硝酸鈉能使血紅蛋白變性，使腦組織缺血缺氧，損害學(xué)習(xí)和記憶過程，引起動物記憶鞏固障礙[6]；乙醇為中樞性抑制劑，測試前20 min腹腔注射較低濃度乙醇即可明顯破壞記憶過程，造成學(xué)習(xí)記憶再現(xiàn)障礙[7]；實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示模型組與正常組未造模訓(xùn)練時(shí)無明顯區(qū)別，造模后測試時(shí)均存在顯著差異，說明學(xué)習(xí)記憶鞏固、再現(xiàn)模型復(fù)制是成功的。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模前固本健腦液組的成績稍好于正常組，表明固本健腦液有一定的益智作用；造模后固本健腦液組的成績明顯優(yōu)于模型組，提示固本健腦液預(yù)防給藥可以改善動物的記憶鞏固、再現(xiàn)障礙。

記憶力障礙是中老年人輕度認(rèn)知障礙和老年癡呆的臨床典型特征[8]，中醫(yī)認(rèn)為“高年無記憶者，腦髓漸空”，說明腦髓是學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)。本課題組認(rèn)為腦髓是由腎中先天精氣所化生，又有賴脾運(yùn)化后天水谷以生精化氣生血，上奉以滋養(yǎng)清竅。脾腎先后天功能健旺才能使腦髓充盈，認(rèn)知、思維等腦的功能也就正常。人至老年，臟腑開始出現(xiàn)生理性的虛衰，脾腎功能逐漸減弱，化源不足，導(dǎo)致先后天精氣逐漸虛少，使得腦髓化生不足，從而出現(xiàn)老年人認(rèn)知功能減低，表現(xiàn)為老年人隨增齡而出現(xiàn)與之相應(yīng)的記憶、思維等功能降低。但如果老年人不注意養(yǎng)生，耗精過度或外邪侵襲，脾腎虧損，就會導(dǎo)致先后天精氣過度減少，使得腦髓嚴(yán)重化生不足或枯竭，從而出現(xiàn)老年人認(rèn)知功能更加減低或障礙，引起輕度認(rèn)知障礙。脾腎虧衰日久，運(yùn)化水液失常導(dǎo)致痰濁，氣虛無力推動血行產(chǎn)生瘀血，痰濁隨氣升降，無處不到，蒙蔽清竅則加重健忘病情；血瘀痹阻腦絡(luò)，腦府靈機(jī)運(yùn)行不暢，加重認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重者脾腎所化之精氣難以上行充腦，從而會產(chǎn)生癡呆。

固本健腦液以黨參、枸杞為君補(bǔ)先后天精氣以充腦髓，佐以茯苓、山楂、酸棗仁健脾寧心以安神，全方共湊補(bǔ)脾益腎、固本健腦、寧心安神的功效。正常衰老的老年人預(yù)防服用固本健腦液，可使脾胃得養(yǎng)，氣血調(diào)和，腦髓得充，認(rèn)知障礙就可得以改善，從而能防治輕度認(rèn)知障礙的發(fā)生，防止出現(xiàn)老年癡呆。

從上述中醫(yī)理論和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，固本健腦液預(yù)防給藥對記憶障礙具有明顯的影響，值得臨床上推廣使用，并應(yīng)深入全面研究其作用機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 朱云峰，袁林，袁德培.固本健腦液對MCI大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬Aβ表達(dá)的影響[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，27(3):5-7.

[2] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第3版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:829-830.

[3] 張磊，張均田.學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)方法和記憶障礙模型[J].藥學(xué)通報(bào),1988,23(8):475.

[4] Kameyame T, Nabeshima T, Kozawa T.Step-down-type passive svidance and escape learning methods[J].Pharmacol Methods,1986(16):39.

[5] 馬作峰，姜瑞雪.固本健腦方改善記憶障礙動物模型記憶功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2005,26(2):47-50.

[6] 侯悅,吳春福,何祥,等.氟哌啶醇對小鼠在避暗實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶獲得、鞏固和再現(xiàn)過程的影響[J].中國臨床康復(fù),2006,34(10):99-102.

[7] 張小超,何波,陳鵬,等.三七皂苷對學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響[J].中藥藥理與臨床,2008,24(3):13-16.

[8] 黃德斌，董志.阿爾茨海默病病因及治療藥物研究進(jìn)展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,24(2):63-66.