白芷中四種線型呋喃香豆素類(lèi)成分藥理作用研究

王夢(mèng)月,賈敏如,馬逾英,李曉波

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 610075;2上海交通大學(xué)藥學(xué)院,上海 200240

白芷為一常用中藥,用于鼻淵頭痛、風(fēng)濕痹痛等病的治療,療效確切。白芷的主要化學(xué)成分為香豆素,我們前期研究首次發(fā)現(xiàn)白芷總香豆素具有明顯的鎮(zhèn)痛和解痙作用,能明顯對(duì)抗熱板、冰醋酸所致小鼠疼痛及 BaCl2所致兔腸平滑肌痙攣[1];秦旭華、Okuyama T等也報(bào)道白芷總香豆素具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[2]、抗腫瘤作用[3]。但白芷鎮(zhèn)痛、解痙、抗腫瘤的活性成分尚不清楚。白芷的主要香豆素類(lèi)成分為異歐前胡素(isoimperatorin,1)、歐前胡素(imperatorin,2)、白當(dāng)歸素(byakangelicin,3)、水合氧化前胡素(oxypeucedanin hydrate,4)等線型呋喃香豆素[4](圖1)。為進(jìn)一步探討白芷鎮(zhèn)痛、解痙、抗腫瘤的活性成分,從而為白芷的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),我們對(duì)上述 4種呋喃香豆素進(jìn)行了鎮(zhèn)痛、解痙、抗腫瘤實(shí)驗(yàn),本文報(bào)道研究結(jié)果。

圖 1 4種呋喃香豆素結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of four furocourmarins

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材

2002年 7月采于四川省遂寧市川白芷 GAP基地,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院賈敏如教授鑒定為杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,憑證標(biāo)本保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。根曬干備用。

1.2 細(xì)胞株

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠:清潔級(jí),體重 20±2 g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證:川實(shí)動(dòng)管 2003(6)號(hào)];新西蘭兔:清潔級(jí),體重 2.0～2.5 kg,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所提供(動(dòng)物合格證:川實(shí)動(dòng)管 99-11號(hào))。

1.4 藥物、試劑及耗材

硫酸羅通定注射液(廣東博羅先鋒藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):020408,使用前用生理鹽水配成 4 mg/mL備用),二甲基亞砜(DMSO,常州市科豐化學(xué)試劑廠),3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT,美國(guó) AMRECO公司),RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó) GibicoBRL公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),乙酰膽堿(廣州化學(xué)試劑公司),氯化鋇(Sigma公司),臺(tái)氏液(新鮮配制)。其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.5 主要儀器

SW-CJ-1C超凈工作臺(tái)(蘇州儀器廠),BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),YLS-6A智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院設(shè)備站),5701水套式 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo Forma公司),ELX800酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Tek公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.5進(jìn)行 One-Way ANOVA檢驗(yàn)及IC50的計(jì)算。

2.2 藥理供試樣品的制備

杭白芷根 30 kg,粉碎成粗粉,150 L乙醇回流提取 3次,回收乙醇得醇浸膏 1334 g。醇浸膏懸浮于水,石油醚(30～60℃)萃取,棄去石油醚部分;繼續(xù)以醋酸乙酯萃取,回收溶劑得總香豆素 477 g。取總香豆素 200 g,行硅膠柱層析,石油醚洗脫,棄去洗脫流份 ;繼用石油醚-醋酸乙酯 (95:5、80:20、60:40、40:60)洗脫,分別得異歐前胡素 1250mg、歐前胡素2345 mg、白當(dāng)歸素 1850 mg、水合氧化前胡素 3680 mg。上述成分均經(jīng)1H NMR、13C NMR、EI-MS等方法確定結(jié)構(gòu)。

4種香豆素均加入 1%的吐溫-80生理鹽水溶液,超聲溶解,配成 0.5%的溶液供鎮(zhèn)痛、解痙實(shí)驗(yàn);用 DMSO配制成所 40、10、2.5、0.625、0.156 μg/mL供抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。

2.3 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.3.1 醋酸扭體法

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)內(nèi)科疾病者；(2)對(duì)鎮(zhèn)痛類(lèi)藥物過(guò)敏者；(3)發(fā)現(xiàn)腕管內(nèi)腫瘤壓迫者或伴有術(shù)前急慢性感染者。

100只小鼠(雌雄各半),隨機(jī)分為 10組,每組10只。陰性對(duì)照組腹腔注射 10 g/kg(體重)的 1%吐溫 80生理鹽水溶液,其余組按表 1劑量腹腔注射給藥。30min后腹腔注射 0.6%醋酸溶液 0.2mL/只。觀察并記錄注射醋酸溶液后的扭體潛伏期及20min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)完畢,按下式計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛百分率:鎮(zhèn)痛率 =(對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/對(duì)照組扭體次數(shù) ×100%[5]。

2.3.2 熱板法

選擇對(duì) 50℃熱板痛覺(jué)反應(yīng)在 10～30 s的小鼠100只,隨機(jī)分為 10組,每組 10只。按表 2劑量腹腔注射給藥(陰性對(duì)照給予 1%吐溫 80生理鹽水溶液),給藥前及給藥后 15,30,60,90 min測(cè)定痛反應(yīng)潛伏期,按下式計(jì)算痛閾提高百分率:痛閾提高百分率 =(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值 ×100%[5]。

2.4 解痙實(shí)驗(yàn)

取兔回腸一段,置盛有冷臺(tái)氏液的平皿中,分離腸系膜,用臺(tái)氏液沖洗干凈,將腸管剪成長(zhǎng) 2～2.5 cm小段。小段腸管兩端穿線結(jié)扎,一端系于通氣鉤上,放入恒溫臺(tái)氏液中,另一端連接 BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。調(diào)節(jié)臺(tái)氏浴槽內(nèi)腸肌張力,觀察正常腸肌活動(dòng)。待自主活動(dòng)穩(wěn)定后,記錄一段正常舒縮曲線,然后每段腸管按 A、B、C、D順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次加藥液前均用臺(tái)氏液沖洗腸肌 3次,待舒縮恢復(fù)至用藥前水平后再加下組試驗(yàn)藥液,記錄舒縮活動(dòng)曲線[6]。

A:加入 0.5%異歐前胡素生理鹽水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 m L,觀察并記錄舒縮曲線。觀察后用臺(tái)氏液沖洗。

B:加入 100μg/mL的乙酰膽堿液 0.4m L,當(dāng)腸肌收縮顯著時(shí)加入 0.5%異歐前胡素生理鹽水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L。觀察后用臺(tái)氏液沖洗。

C:加入 100mg/mL的氯化鋇液 0.2mL,待收縮顯著時(shí)加入 0.5%異歐前胡素生理鹽水溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2m L。

D:換腸管,分別取歐前胡素、白當(dāng)歸素、水合氧化前胡素按上述順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化,計(jì)數(shù),5 000個(gè)每孔鋪于 96孔板,在 37℃、含 5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后,加入藥物(DMSO溶解),每個(gè)藥物濃度設(shè) 3個(gè)平行孔,連續(xù)培養(yǎng) 48 h后,每孔加入 20μL 5 g/L的MTT,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,貼壁細(xì)胞傾去培養(yǎng)基后每孔加入 150μL DMSO,輕輕震搖;懸浮細(xì)胞每孔加入 50 μL的三聯(lián)液(10%SDS-5%異丁醇-0.1%鹽酸),37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 570 nm吸光度(A)值,并按下式計(jì)算抑制率:抑制率 =(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組 A值)/對(duì)照組 A值 ×100%[7]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

3.1.1 醋酸扭體法

結(jié)果見(jiàn)表 1。四種香豆素均顯著減少醋酸所致小鼠的扭體次數(shù)。異歐前胡素、歐前胡素還能明顯延遲小鼠扭體的出現(xiàn),而水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素則無(wú)明顯作用。4種呋喃香豆素類(lèi)成分中歐前胡素的作用最強(qiáng),75mg/kg的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度超過(guò) 40mg/kg的顱痛定。

表 1 四種呋喃香豆素對(duì)醋酸所致小鼠疼痛的影響Table 1 Effect on rats'pain caused by acetic acid

3.1.2 熱板法

結(jié)果見(jiàn)表 2。異歐前胡素及歐前胡素均有顯著的鎮(zhèn)痛作用,能明顯抑制熱板法所致小鼠疼痛,歐前胡素的作用明顯強(qiáng)于異歐前胡素。白當(dāng)歸素、水合氧化前胡素?zé)o明顯作用。

表 2 四種呋喃香豆素對(duì)熱板致小鼠疼痛反應(yīng)的影響Table 2 Effect on rats'pain caused by hot board

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note:*P＜0.05,**P＜0.01 vs NSgroup.

3.2 解痙實(shí)驗(yàn)

結(jié)果:4種香豆素對(duì)正常兔腸平滑肌舒縮均無(wú)明顯影響;均不能顯著緩解乙酰膽堿引起的兔腸平滑肌痙攣;異歐前胡素、歐前胡素、水合氧化前胡素液能明顯緩解氯化鋇引起的腸管平滑肌痙攣,白當(dāng)歸素?zé)o明顯作用。

3.3 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表 3。異歐前胡素、水合氧化前胡素均有抗腫瘤作用,對(duì) HL-60、HELA、P388、A549等 4種細(xì)胞株的生長(zhǎng)均有顯著抑制作用,并呈明顯的量效關(guān)系。而歐前胡素、白當(dāng)歸素未觀察到明顯作用。

表 3 四種呋喃香豆素對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用(n=3)Table 3 The inhibition ratio of 4 furocoumarins on 6 tumor cells

注:+有活性;-無(wú)活性。Note:+positive;-Negative.

4 討論

白芷及其某些復(fù)方制劑在臨床上廣泛用于頭痛、牙痛、三叉神經(jīng)痛等多種疼痛的治療,療效顯著,但目前白芷鎮(zhèn)痛的有效成分尚不明確。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)白芷中的歐前胡素、異歐前胡素具有明顯的鎮(zhèn)痛作用,除能直接對(duì)抗由熱、醋酸等物理、化學(xué)刺激引起的疼痛外,還能緩解平滑肌痙攣,是白芷鎮(zhèn)痛的活性成分。此外,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)白芷中的異歐前胡素、水合氧化前胡素具有明顯抗腫瘤作用。上述研究為白芷的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

目前中國(guó)藥典僅規(guī)定白芷中歐前胡素的含量,我們發(fā)現(xiàn)異歐前胡素、水合氧化前胡素等成分亦具有明顯的鎮(zhèn)痛、解痙活性。文獻(xiàn)也報(bào)道異歐前胡素具明顯解痙作用及光敏活性[8]。結(jié)合白芷的功效,建議將異歐前胡素、水合氧化前胡素也作為白芷質(zhì)量控制指標(biāo)。

本文所采用的 4種香豆素為白芷的主要成分,結(jié)構(gòu)均為線型呋喃香豆素,母核相同,僅取代基及取代位置不同。但它們?cè)阪?zhèn)痛、緩解平滑肌痙攣、細(xì)胞毒等方面的作用均有明顯差異,提示取代基的類(lèi)型及取代位置對(duì)線型呋喃香豆素的生物活性具有顯著影響。白芷中線型呋喃香豆素類(lèi)成分的構(gòu)效關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

致謝抗腫瘤活性測(cè)試由國(guó)家新藥篩選中心完成;乙醇提取工作由四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部完成;成都中醫(yī)藥大學(xué)黃國(guó)鈞教授、唐聲武教授、蔣桂華副教授提供了必要幫助,在此一并表示感謝。

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