烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞INHB、FSHRmRNA及分泌功能的影響*

李 玲，金 哲，黃文玲，林佳靜，蔡品均

（1.北京中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078）

烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞INHB、FSHRmRNA及分泌功能的影響*

李 玲1，金 哲2，黃文玲2，林佳靜1，蔡品均1

（1.北京中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078）

[目的]運用血清藥理學方法觀察烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞抑制素（INHB）、促卵泡激素受體（FSHR）mRNA的表達及其分泌功能的影響。[方法]在大鼠卵巢顆粒細胞培養(yǎng)體系中加入烏萸湯、尿促卵泡激素（FSH）及正常大鼠含藥血清，培養(yǎng)48 h后，分別用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）及放免法測定顆粒細胞 INHB、FSHR、mRNA及培養(yǎng)液中雌二醇（E2）含量。[結果]各用藥血清組E2含量較對照組均明顯升高；顆粒細胞INHB、FSHRmRNA表達量明顯增多，其中烏萸湯中劑量血清組效果優(yōu)于西藥組。[結論]烏萸湯含藥血清能明顯促進卵巢顆粒細胞INHB、FSHRmRNA的表達以及E2分泌，說明烏萸湯可以通過調控卵巢局部因子、增強FSHRmRNA的表達從而提高卵巢對促性腺激素的反應性，改善下丘腦-垂體-卵巢軸，促進E2的分泌，以促進卵泡發(fā)育成熟及排出。

烏萸湯；卵巢顆粒細胞；抑制素；促卵泡素受體；雌二醇

卵巢顆粒細胞（GC）是卵泡內主要的功能細胞之一，是雌激素和孕激素的主要來源細胞。GC的增殖和分化是卵泡不斷發(fā)育和成熟的基本條件。本研究組前期的動物實驗證明，補腎調肝方烏萸湯可提高卵巢儲備功能，促進卵泡發(fā)育。本實驗運用血清藥理學原理，研究烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞分泌及促卵泡激素受體mRNA（FSHRmRNA）、抑制素（INHB）表達的影響，以進一步了解烏萸湯調節(jié)卵巢功能的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠25只，SPF級，6周齡，體質量（150±20）g；未成年雌性SD大鼠10只，21～25日齡，體質量50～70 g。北京維通利華實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物 補腎調肝方烏萸湯組方：烏藥、山茱萸、菟絲子、肉蓯蓉、丹參、雞血藤、香附、煅紫石英等。按課題需要計算得出總量，將藥物從北京同仁堂股份有限公司一次性購入，核實飲片基原、產地、批號、性狀，根據(jù)《中華人民共和國藥典（2005年版）》要求鑒定為正品后，由北京中醫(yī)藥大學制劑室按常規(guī)方法一次性煎煮、濃縮，按照所需配成高、中、低濃度藥液，2～8℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器 注射用尿促卵泡激素（FSH 75IU/支）購自麗珠制藥廠，孕馬血清（PMSG1000IU/支）購自內蒙古赤峰博恩藥業(yè)有限公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM-F12培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液均購自美國生命技術公司（GIBCO/BRL）；雌二醇（E2）放免檢測藥盒，購自北京北方生物技術研究所。聚合酶鏈式反應（PCR）引物，購自北京三博遠志生物技術有限公司。Trizol購自Invitrogen公司，反轉錄酶（M-MLV Reverse Transcriptase） 購自 Promega公司，DNA Marker購自全式金生物技術有限公司，瓊脂糖購自深圳晶美公司；INHB酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，購于武漢中美生物試劑有限公司。

低溫高速離心機：Sigma；半自動發(fā)光儀：日本濱松；光學顯微鏡：NIKON ECL IPSE E600；全自動酶標儀：Model550型Microplate Reader。倒置相差顯微鏡，日本Olympus IMT－2型。二氧化碳培養(yǎng)箱，美國NAPCOMODEL5410。超凈工作臺，北京昌平長城空氣凈化工程公司CJT-E-Ⅱ型。電熱恒溫水箱，上海實驗儀器廠，HH-W21.420型。

2 實驗方法

2.1 大鼠含烏萸湯中藥血清與正常血清制備 取25只6周齡雌性SD大鼠隨機分為5組，飼養(yǎng)和實驗均在屏障環(huán)境動物實驗室內進行。小鼠飼料、墊料、飲用水均經過消毒處理。正常對照組每日灌服0.5%的羧甲基纖維素鈉（C MC）1.0mL/kg；大、中、小劑量組每日灌服烏萸湯濃縮液5、10、15mL/kg（分別相當于成人劑量的6倍、12倍、18倍），連續(xù)給藥4 d；西藥對照組大鼠每日皮下注射FSH 78 U/kg，連續(xù)4 d，各組樣本均無死亡。于末次給藥后1 h無菌狀態(tài)下大鼠股動脈采血，分離血清，將每組血清混勻，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 卵巢顆粒細胞的分離與原代培養(yǎng) 參照Lovekamp等[1]的方法，取10只上述未成年雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 100 IU，48 h后頸椎脫臼法處死。75%乙醇浸泡消毒，在無菌條件下迅速剖取卵巢放入冰冷的無菌PBS中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于冰冷的DMEM-F12培養(yǎng)基中。在解剖顯微鏡下用小號針頭刺破卵泡，使顆粒細胞釋放入培養(yǎng)基，200目不銹鋼細胞篩過濾。800 r/min離心5min，洗滌濾液，收集細胞。加入培養(yǎng)液（D MEM-F12培養(yǎng)基、15%胎牛血清、105U/L，青霉素和105U/L鏈霉素）制成單細胞懸液。臺盼藍染色，計數(shù)。將細胞稀釋成濃度為3.0×108個/L的細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h后，細胞可貼壁生長，換液去除未貼壁細胞；此后隔日換液1次。

2.3 細胞培養(yǎng)及分組 顆粒細胞預培養(yǎng)24 h后分6組換液，每組于含15%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中分別加入10%的大、中、小劑量組中藥血清、西藥對照組血清、正常大鼠對照組血清，并設空白對照組（DMEM-F12培養(yǎng)基）。每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

2.4 用放免法測定烏萸湯方含藥血清對顆粒細胞培養(yǎng)液中E2分泌的影響 用放射免疫法測定各組細胞上清液E2的含量。測定均按照試劑盒說明書進行。放射免疫法分析符合質控要求，批內變異系數(shù)<10%，批間變異系數(shù)<15%。

2.5 烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞FSHR mRNA表達量的定量測定 用實時熒光逆轉聚合酶鏈反應（RT－PCR）方法實時、定量測定顆粒細胞FSHR mRNA的表達量。

2.6 烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞INHB的影響 本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）技術，觀察烏萸湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞INHB的表達的影響。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用one－Way ANOVA進行分析。

3 結果

3.1 烏萸湯含藥血清對各組卵巢GC分泌E2及FSHRmRNA、INHB的表達影響 見表1。

表1 烏萸湯含藥血清對各組卵巢GC分泌E2及FSHRm RNA、INHB的表達影響(±s)Tab.1 effectsofW u Yu decoction drug-containing serum on serection of E2 ofGC and the expression of FSHRmRN,INBH of GC(±s)

表1 烏萸湯含藥血清對各組卵巢GC分泌E2及FSHRm RNA、INHB的表達影響(±s)Tab.1 effectsofW u Yu decoction drug-containing serum on serection of E2 ofGC and the expression of FSHRmRN,INBH of GC(±s)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與西藥對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與烏萸湯低劑量組比較☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與烏萸湯中劑量組比較★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別 n E2空白對照組正常對照組西藥對照組烏萸湯低烏萸湯中烏萸湯高6 6 6 6 6 6(pg/105)15.8317±2.8444 17.8867±3.3713 41.3500±11.029**▲▲35.6017±12.896**▲▲34.7600±9.0657**▲▲32.5050±4.1909**▲▲GCFSHRmRNA（起始拷貝數(shù)）1.1333±0.1797△△1.0267±0.1453△△5.6067±0.4273**▲▲5.3450±0.4093**▲▲7.9217±0.7511**▲▲△△☆☆5.0350±0.4984**▲▲△★★INHB(pg/105)15.8922±0.0353 15.8213±0.0381 16.8973±0.1029 16.7913±1.0916 19.2798±1.0518**▲▲△△☆☆17.7770±1.4172**▲▲

由表1可見，空白對照組與未用藥大鼠血清組的E2分泌及FSHRmRNA、INHB的表達量差異無統(tǒng)計學意義，與空白及正常對照組相比，各加藥組E2、FSHRmRNA、INHB的表達量均明顯增高（P<0.01）；與西藥血清組比較，烏萸湯低、中、高劑量血清組 E2水平偏低，但無顯著性差異（P>0.05），烏萸湯中、高劑量血清組FSHRmRNA、INHB表達有顯著性升高（P>0.05）。

3.2 Real-time PCR結果

3.2.1 標準曲線的生成 將預實驗的PCR產物（mRNA表達比較高的）按照濃度梯度進行稀釋，選擇1/5，1/10，1/20，1/40濃度的稀釋產物作為標準品模版，進行熒光定量PCR反應。通過這4個標準品生成的反應數(shù)據(jù)，軟件Rotor-Gene 6.0根據(jù)反應的熒光實時監(jiān)控數(shù)據(jù)和標準品的濃度關系，生成標準曲線，見圖1。

3.2.2 FSHR Real-Time PCR溶解曲線，溶解曲線圖顯示擴增的內參基因GAPDH和目的基因FSHR cDNA的溶解溫度(Tm)分別為87.0℃，85.0℃，且均為單峰。無非特異性擴增，見圖2。

4 討論

FSH是調節(jié)女性卵巢功能的關鍵激素，但FSH需與位于卵巢顆粒細胞上的FSHR結合后方可激活顆粒細胞內的芳香化酶(P450arom)，使卵泡膜細胞產生的雄激素芳香化并形成卵泡自身內的雌激素微環(huán)境[2]。因此，雌激素的生成還受卵泡內FSHR含量的限制，卵巢對促性腺激素的反應與顆粒細胞FSHRmRNA的表達量高低有關[3]。抑制素INHB是一種選擇性抑制FSH分泌的性腺肽，可以增強卵巢-垂體軸的反饋性調節(jié)[4]。INHB主要由卵巢顆粒細胞分泌，卵巢儲備功能出現(xiàn)減退時，血清INHB先于FSH產生變化。血清INHB水平降低是女性卵泡減少、卵巢老化的最早標志[5]，在生殖內分泌領域具有重要意義。INHB對FSH負反饋調節(jié)的減弱，可導致FSH水平的增高。INHB還可以通過調節(jié)增加E2底物來調節(jié)E2的產生。因此，INHB和FSH、E2一樣可以反映卵巢的功能狀態(tài)。

本實驗結果提示各用藥組GC分泌E2均有提高，而FSH含藥血清提高GC分泌E2效果優(yōu)于中藥各組；補腎調肝方烏萸湯可以增加卵巢顆粒細胞INHB和FSHRmRNA的表達，其中劑量組效果優(yōu)于FSH含藥血清組，由此可見，烏萸湯可通過提高卵巢對促性腺激素的反應性及調控卵巢局部因子途徑為靶點，調節(jié)下丘腦-垂體-卵巢系統(tǒng)，同時可直接對卵巢起調節(jié)作用。從而說明補腎調肝治療對女性性腺軸功能具有雙相調節(jié)作用，能夠使下丘腦-垂體-性腺軸的功能得以改善，達到促進卵泡發(fā)育成熟以調經促孕的目的。中藥的多靶點、多環(huán)節(jié)調節(jié)作用，而不僅僅是代替激素的作用，可能正是中醫(yī)藥調節(jié)生殖內分泌的特點和意義所在。

[1]Lovekamp TN,Davis BJ.Mono-(2-ethylhexy)phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulosa cells[J].ToxicolApplPharmacol,2001,172(3):217-224.

[2]De Castro F,Ruiz R,Montoro L,et al.Role of follicle-stimulating hormone receptor Ser680Asn polymorphism in the efficacy of follicle-stimulatinghormone[J].Fertil Steril,2003,80(3):571-576.

[3]樓航英,黃荷鳳,金 帆.超排卵時卵巢對促性腺激素的反應與顆粒細胞促卵泡激素受體的表達[J].浙江大學學報 (醫(yī)學版),2002，31(3)∶151-154.

[4]AriciA,Matalliotakis IM,KoumantakisGE etal1 Diagnostic role of inhibin B in resistant ovary syndrome associated with secondary amenorrhea1 FertilSteril,2002,78(6):324-326.

[5]SHYR-Yeu Lin,John RMorrison,David J,etal.Regulation ofovarian function by the TGF-superfamily and follistatin[J].Reproduction,2003,126:133-148.

Effects of Wu Yu decoction drug-containing serum on expression of INHB,FSHRm RNA in ovarian granulose celland secretion function

LILING1,HUANGWen-ling2,JIN Zhe2,atal
(1.ClinicalCollegeofBeijing University ofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.DepartmentofGynecology,Dong Fang Hospital,Beijing University ofChineseMedicine,Beijing 100078,China)

[Objective]To research theeffectsofWu Yu decoction drug-containing serum on the expression of INHB,FSHRmRNA in ovarian granulose cell(abbr.GC)and the secretion function in rats.[Methods]Wu Yu decoction,FSH drug-containing serum and the normal ratserum were added into ratovarian GC culturemedium system.Theywere cultured for48 hours.The expression of INHBwasmeasured by ELISA,FSHRmRNA expression levels by RT-PCR,E2 levelsofeach group by radioimmunoassay.[Results]The E2 levelwas significantly higher in treatmentgroups than that in controlgroups,and the expression of INHB,FSHRmRNA significantly increased,among themmedium dosagegroup ofWu Yu decoctionwas superior than that inWesternmedicine groups.[Conclusion]Wu Yu decoction drug-containing serum promotes the expression of INHB,FSHRmRNA and secretion of E2 ofovarian GC significantly.It is proved thatWu Yu decoction can enhance the ovarian reaction function to gonadotropins and improve the HPOA through adjusting internal factors ofovary and enhancing the expression of FSHRmRNA,thereby to promote the developmentandmaturation of follicular and ovulation.

Wu Yu decoction；ovarian granulose cell；INHB； FSHRmRNA；E2

R285.5

A

1672-1519(2010)02-0144-03

教育部新教師基金（20070026036）。

李 玲（1977-），女，博士研究生，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)婦科內分泌、輔助生殖方面研究。

2009-12-26）