采用LC-MS/MS檢測(cè)人尿中睪內(nèi)脂方法研究

陸江海 秦旸 楊樹民 徐友宣 吳侔天

國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

睪內(nèi)脂（testolactone，結(jié)構(gòu)見圖1）是一種阻止睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇和雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌酮的芳香酶抑制劑，臨床上用于治療男性不育等疾?。?］。睪內(nèi)脂同時(shí)也被國(guó)際反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）列為禁用藥物［2］，對(duì)于它的檢測(cè)國(guó)外文獻(xiàn)主要采取HPLC法［3］，本研究首次采用LC-MS/MS法檢測(cè)人尿中的睪內(nèi)脂，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器、試藥

AgilentTechnologies6410 Triple Quad LC/MS；MettlerToledo電子天平；Sample concentrator（Bibby Scientific）；低速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；低溫恒溫液浴循環(huán)兩用槽（杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司）；Millipore超純水機(jī)。

睪內(nèi)脂和內(nèi)標(biāo)甲睪（來源：德國(guó)科隆興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室）；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鉀、碳酸氫鈉（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；β-葡萄糖醛酸苷酶（Sigma公司）；叔丁基甲醚、乙腈、甲酸、甲酸銨（Dima公司）。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZorbax XDB-C18柱（2.1×50mm,3.5μm）；流動(dòng)相采用pH3.5甲酸銨緩沖液（A）和乙腈（B）進(jìn)行梯度洗脫；淋洗梯度：0分鐘A90%，B10%，7分鐘A10%，B90%。流速：0.5毫升/分鐘，運(yùn)行時(shí)間7分鐘，平衡時(shí)間3分鐘；進(jìn)樣量10μl；柱溫40℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子檢測(cè)（MRM）（見圖2）；離子極性為正離子（positive）；離子化方式為電噴霧離子化（ESI）；毛細(xì)管電壓為 4000伏（V）；干燥氣溫度：330℃；干燥氣流速：10.0升/分鐘，霧化氣壓力：35psi，碰撞電壓（Fragmentor）：100伏（V）；用于定量的離子對(duì)為 m/z 301→121，碰撞能量（Collision Energy，CE）：45 伏（V）；用于定性的離子對(duì)為m/z 301→225，碰撞能量：20電子伏特（eV）。

1.3 溶液配制

稱取睪內(nèi)脂對(duì)照品0.73mg，配制成1mg/ml儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液用超純水稀釋成系列對(duì)照品供分析用。

稱取內(nèi)標(biāo)甲睪1.23mg，配制成1mg/ml儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成10μg/ml內(nèi)標(biāo)溶液供分析用。

1.4 樣品前處理

在 2ml尿樣中加入內(nèi)標(biāo) 20μl，0.2M 中性磷酸緩沖液 1ml，β-葡萄糖醛酸苷酶 50μl，混勻后 55℃溫浴 1小時(shí)后，加入0.5ml pH10的碳酸氫鈉緩沖液、4ml叔丁基甲醚，振蕩10分鐘，離心5分鐘，－30℃冷凍分離，取上層有機(jī)相。55℃氮?dú)獯蹈?，將殘留物溶解?00μl流動(dòng)相中，進(jìn)樣 10μl于 LC-MS/MS。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性

在上述條件下，睪內(nèi)脂保留時(shí)間為4.4分鐘，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為5.4分鐘。結(jié)果表明：人尿中雜質(zhì)不干擾樣品和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，基線噪音小，在此條件下測(cè)得的結(jié)果能代表原藥的濃度，見圖3，4。

2.2 人尿中藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量睪內(nèi)脂對(duì)照液用氮?dú)獯蹈?，加入空白人?ml，使人尿中的睪內(nèi)脂濃度的增加為 0.1μg、0.5μg、2μg、5μg、10μg、25μg、50μg/ml，按“1.4”項(xiàng)操作，以睪內(nèi)脂濃度的增加值X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，睪內(nèi)脂和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=0.2336X+0.6137，r=0.9984，睪內(nèi)脂線性范圍為0.1～50μg/ml，定量下限為0.1μg/ml，S/N>10。

2.3 精密度試驗(yàn)

取空白尿 2ml，按“1.4”項(xiàng)操作，使人尿中的睪內(nèi)脂濃度增加值分別為 0.1μg、1μg、10μg/ml，每個(gè)濃度取 6份樣本（n=6+6+6）進(jìn)行分析，連續(xù)測(cè)定3天，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣本的濃度。得到日內(nèi)和日間RSD，低、中、高3種濃度的日內(nèi)和日間RSD分別為7.84%、5.81%、1.51%和 5.70%、5.36%、1.67%。結(jié)果表明，精密度符合常規(guī)檢測(cè)要求。

2.4 提取回收率

取空白尿 2ml，按“1.4”項(xiàng)操作，但 20μl內(nèi)標(biāo)和0.2μg、2μg、20μg 睪內(nèi)脂分別在 55℃氮?dú)獯蹈汕凹尤耄M(jìn)樣分析。計(jì)算睪內(nèi)脂和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（fs）。

取空白尿2ml，按“1.4”項(xiàng)操作，使人尿中的睪內(nèi)脂濃度增加值分別為 0.1μg、1μg、10μg/ml, 進(jìn)樣分析。得到睪內(nèi)脂和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（fx），提取回收率（R）按 R=fx/fs×100%計(jì)算，低、中、高3種濃度的提取回收率分別為 56.2%、68.1%、66.6%；RSD 分別為 3.81%、4.70%、7.23%。

2.5 最低檢測(cè)下限

取適量睪內(nèi)脂對(duì)照液用氮?dú)獯蹈?，加入空白人?ml，使人尿中的睪內(nèi)脂濃度的增加為 0.5ng、1ng、2ng、5ng、10ng、25ng/ml，按“1.4”項(xiàng)操作，測(cè)得最低檢測(cè)下限為 1ng/ml，S/N=3。

3 總結(jié)

睪內(nèi)脂是國(guó)際反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）禁用藥物清單上的藥物，關(guān)于它的文獻(xiàn)很少，僅有一篇HPLC法檢測(cè)的文章。本文首次對(duì)采用LC-MS/MS方法檢測(cè)睪內(nèi)脂進(jìn)行研究，所選用的兩對(duì)離子對(duì)（301→121、301→225）具有高靈敏度和強(qiáng)專屬性的特點(diǎn)，國(guó)際反興奮劑機(jī)構(gòu)對(duì)睪內(nèi)脂的最低檢測(cè)能力要求是10ng/ml，本方法可以做到檢測(cè)1ng/ml的樣品，且分析時(shí)間短（分析時(shí)間+柱平衡時(shí)間為10分鐘），對(duì)睪內(nèi)脂的常規(guī)檢測(cè)有很大的幫助，取得了較為滿意的結(jié)果。

［1］RamanJ，SchlegelPN.Aromatase inhibitors for male infertility.J Urol，2002，167：624-629.

［2］http://www.wada-ama.org/en/prohibitedlist.ch2.

［3］PascucciVL，YeagerRL，SherinsRJ.Quantitation of testolactone and 4,5-dihydrotestolaction in plasma and urine using high-performance liquid chromatography.J Chromatogr，1983，14：79-85.