補(bǔ)充葛根素對力竭游泳訓(xùn)練大鼠海馬細(xì)胞凋亡及Bcl-2、P53蛋白表達(dá)的影響

程麗彩 何玉秀

1鄭州大學(xué)體育學(xué)院（鄭州 450044） 2河北師范大學(xué)體育學(xué)院

葛根素（4，7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，Puerrin，Pur）是一種天然的植物雌激素，主要由豆科植物野葛根中提取獲得，并在多種葛屬植物中廣泛存在。近年來，關(guān)于細(xì)胞凋亡與神經(jīng)系統(tǒng)功能關(guān)系的研究證實，葛根素對缺血性腦卒中、老年性癡呆、缺血再灌注損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］，但其對運動訓(xùn)練導(dǎo)致的大鼠創(chuàng)傷性腦損傷及學(xué)習(xí)記憶功能的影響少見報道。

研究發(fā)現(xiàn)，運動引起人體細(xì)胞凋亡的功能意義是機(jī)體部分清除損傷細(xì)胞的正常生理過程，是組織自我保護(hù)機(jī)能的反映［2］，而大量細(xì)胞凋亡則會造成組織器官、系統(tǒng)功能下降，有可能是運動性疲勞的機(jī)制之一。由于大腦是控制、調(diào)節(jié)人體隨意運動的重要系統(tǒng)，在人體運動過程中起主導(dǎo)作用。大腦海馬區(qū)與學(xué)習(xí)、記憶等腦的高級功能以及腦的老化密切相關(guān)。本研究通過建立大鼠力竭性訓(xùn)練模型，采用流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)數(shù)據(jù)，觀察力竭性運動訓(xùn)練后腦組織海馬細(xì)胞凋亡以及葛根素補(bǔ)充對于海馬細(xì)胞凋亡和相關(guān)基因Bcl-2、P53蛋白表達(dá)的影響，探討海馬細(xì)胞凋亡在運動訓(xùn)練導(dǎo)致的機(jī)體病理改變中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制，為葛根素作為運動保健品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

選取雄性Sprague-Dawley純種大鼠30只，2月齡，體重240～260g，由河南省實驗動物中心提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：安靜對照組（C，10只）、力竭訓(xùn)練組（E，10只）和力竭訓(xùn)練+葛根素補(bǔ)充組（PE，10只）。分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，室溫20℃～26℃，每日自然光照12小時。

1.2 實驗方案

力竭訓(xùn)練組和葛根素補(bǔ)充組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，進(jìn)行3天適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，30min/d。正式實驗開始后此強(qiáng)度在1周內(nèi)延長至120min，然后進(jìn)入力竭性游泳訓(xùn)練期。大鼠于上午進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練，運動至力竭，1次/d，5d/w，持續(xù)訓(xùn)練4周。水溫30℃±2℃，水深 70厘米。對于短時間內(nèi)力竭的大鼠，撈出休息5min后，再進(jìn)行游泳訓(xùn)練，使訓(xùn)練時間不少于120min。

力竭標(biāo)準(zhǔn)［3］：大鼠沉入水下無法返回水面超過10s；大鼠協(xié)調(diào)運動消失，在水中不定向亂竄，未達(dá)到10s亦定為力竭。

葛根素補(bǔ)充組大鼠從適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后開始灌胃葛根素注射液（北京賽生藥業(yè)有限公司提供，批號0801153），每天1次，劑量為100mg/kg。對照組及單純力竭運動組以等量生理鹽水灌胃。

1.3 取材

第4周運動結(jié)束后取材。取材前大鼠禁食12h以上，訓(xùn)練組停訓(xùn)24h。用2%戊巴比妥鈉（2.3ml/kg）腹腔注射麻醉，斷頭后立即取腦，并迅速在－20℃預(yù)冷的托盤上將海馬組織分離出來，放入備好的細(xì)胞培養(yǎng)液待測，其余腦組織10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度 5μm，HE染色。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 海馬細(xì)胞凋亡率和增殖指數(shù)測定

單細(xì)胞懸液制備：取新鮮大鼠海馬組織，用眼科剪刀邊剪邊用PBS液沖洗，直至將組織剪碎。過濾2次，收集細(xì)胞懸液，離心清洗2次。顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，制成標(biāo)準(zhǔn)的單細(xì)胞懸液［4］。

海馬細(xì)胞凋亡率測定：取海馬單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)控制在 1×106個，離心棄去固定液，PBS清洗 2次，200目篩網(wǎng)過濾1次。用PI一步染色法在4℃冰箱避光染色30min。染色結(jié)束用PBS清洗2次，洗去染液，即可上機(jī)檢測。激發(fā)光源為15mW氬離子激光器，激發(fā)波長為488nm，應(yīng)用Expo32ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用MuticycleAV分析軟件對DNA細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

細(xì)胞增殖指數(shù)測量：應(yīng)用DNA細(xì)胞周期分析軟件，計算出DNA組方圖各時相分布的百分比，以增殖指數(shù)（PI）表示細(xì)胞的增殖活性，公式為：PI＝（S＋G2M）／（G0/G1＋S＋G2M）×100%。

1.4.2 海馬細(xì)胞凋亡基因蛋白表達(dá)測定

取單細(xì)胞懸液100μl，加入鼠抗人Bcl-2單克隆抗體工作液100μl，室溫避光孵育30min，洗滌一次，加入羊抗鼠 FITC-IgG二抗工作液 100μl，避光室溫孵育 30min，加入PBS10ml離心（同上），棄上清以除去未結(jié)合的熒光二抗，加入PBS，經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。

P53測定：同樣取單細(xì)胞懸液 100μl，先用 P53－FITC進(jìn)行核抗原標(biāo)記，再用溴化丙啶（PI）染DNA，避光室溫孵育30min，加PBS10ml離心，棄上清，加入PBS上機(jī)檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均使用Spss 11.5分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異分析采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

C組大鼠大腦海馬細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，細(xì)胞間質(zhì)均勻、致密，未見異常改變。E組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞胞體增大、細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)凝集并邊向集中，染色加深，凝集成塊。PE組神經(jīng)細(xì)胞凋亡依然存在，但相比E組，數(shù)量大大減少。

2.2 海馬細(xì)胞凋亡率和增殖指數(shù)

由表1可知，與C組相比，E組和PE組海馬細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），E組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高（P<0.05）。與E組相比，PE組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著下降（P<0.01），增殖指數(shù)也呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡率、增殖指數(shù)比較

2.3 凋亡基因Bcl-2、P53蛋白表達(dá)

由表2可知，與C組相比，E組海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著下降（P<0.05），P53表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與E組相比，PE組海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著升高（P<0.05），P53表達(dá)顯著下降（P<0.05）。

表2 各組大鼠大腦海馬細(xì)胞Bcl-2、P53比較

3 討論

3.1 力竭訓(xùn)練后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡

科學(xué)系統(tǒng)的運動訓(xùn)練可使機(jī)體產(chǎn)生良好的適應(yīng)，而長期大強(qiáng)度訓(xùn)練，特別是力竭性運動可對機(jī)體產(chǎn)生不同程度的損傷，并與機(jī)體運動性疲勞和運動后細(xì)胞損傷有密切的關(guān)系［5-8］。由于大腦在大強(qiáng)度運動時處于相對缺血、缺氧狀態(tài)，腦組織細(xì)胞自由基產(chǎn)生增加，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞線粒體鈣超載，發(fā)生缺血、缺氧性損傷，從而導(dǎo)致腦組織細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，力竭訓(xùn)練組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分比明顯高于對照組。在HE染色結(jié)果中也可見該組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變。

3.2 葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用

多項研究證明，Pur對于腦缺血導(dǎo)致的中樞神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用［9-11］。研究發(fā)現(xiàn)，Pur對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用機(jī)制可能有：Bcl-2是線粒體外膜蛋白，能抑制CytoC從線粒體釋放，并與蛋白酶活化因子1（Apaf-1）結(jié)合以阻止胞質(zhì)中的CytoC與Apaf-1結(jié)合，從而抑制Caspase-9的激活［12］。Bcl-2也可通過結(jié)合到線粒體膜關(guān)閉線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔從而阻止細(xì)胞凋亡［13］。CytoC是電活動轉(zhuǎn)運蛋白，通常位于線粒體的膜內(nèi)區(qū)域。胞漿內(nèi)的CytoC激活Caspase-3是引起凋亡的必要條件，而Bcl-2上調(diào)對兩者促凋亡作用有明顯的抑制作用。本實驗結(jié)果顯示，E組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著上升，PE組則顯著下降，而且Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說明葛根素可以通過上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，這與同類研究結(jié)果是一致的［14］。

轉(zhuǎn)錄因子P53可激活上百種基因表達(dá)，這些P53靶基因直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA損傷的修復(fù)，以及細(xì)胞衰老、分化及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Panahian等［15］證實抑制P53基因表達(dá)則可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對缺血性腦損害具有保護(hù)作用。P53可能通過控制Fas受體的激活或者直接進(jìn)入線粒體而控制細(xì)胞色素C的釋放。Fas作為一種重要的促進(jìn)凋亡的調(diào)控基因，屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體家族，其表達(dá)產(chǎn)物具有傳遞凋亡信號的作用，作為死亡受體的Fas與Fas配體結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16，17］。有實驗證實，給予葛根素補(bǔ)充的大鼠缺血再灌注6～48h時Fas表達(dá)顯著降低，缺血再灌注24～48h時P53表達(dá)亦明顯減少，且凋亡細(xì)胞數(shù)也明顯減少，提示葛根素具有抗凋亡作用，其機(jī)制可能與P53蛋白表達(dá)有關(guān)［18］。

Pur作為一種異黃酮，具有顯著的抗氧化作用，因此Pur也可通過抑制缺血誘導(dǎo)的氧化損傷，清除自由基和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的因子，發(fā)生細(xì)胞保護(hù)作用。吳平等［19］實驗研究證實Pur能增加大鼠腦組織NOS活性及NO含量，這可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一。

細(xì)胞流式儀檢測分析一個群體細(xì)胞DNA倍體與細(xì)胞周期時，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1、S、G2/M期三個細(xì)胞峰。增殖指數(shù)為S期和G2/M期細(xì)胞總和占細(xì)胞周期中細(xì)胞總數(shù)的百分比，代表細(xì)胞的增殖活性。本實驗結(jié)果顯示：與E組相比，EP組凋亡細(xì)胞數(shù)量大幅下降，凋亡率顯著降低（P<0.01），而增值指數(shù)沒有太大變化，G1期細(xì)胞減少，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定。這說明葛根素有較強(qiáng)的抑制海馬細(xì)胞凋亡的能力，可促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，增強(qiáng)整個細(xì)胞的增殖水平，以利于機(jī)體的進(jìn)一步恢復(fù)。

4 總結(jié)

力竭性運動訓(xùn)練能誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡過度增加，造成組織器官、系統(tǒng)功能下降。補(bǔ)充葛根素可以通過上調(diào)凋亡基因Bcl-2及下調(diào)P53蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，對大腦海馬細(xì)胞有保護(hù)作用，值得進(jìn)一步研究。

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