毛刺屬線蟲傳毒種及其研究進展

陳吳健，吳 蓉，林曉佳

（浙江出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 310012）

毛刺屬線蟲傳毒種及其研究進展

陳吳健，吳 蓉，林曉佳

（浙江出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 310012）

摘要：介紹了毛刺屬線蟲的圓桶毛刺線蟲（Trichodorus cylindricus）、原始毛刺線蟲（T. primitivus）、具毒毛刺線蟲（T. viruliferus）、相似毛刺線蟲（T. similis）4種傳毒線蟲種類，綜述了這4種傳毒種毛刺屬線蟲傳毒的?；浴⑿螒B(tài)學鑒定、分子生物學鑒定的研究進展，并提出了檢疫部門今后的研究重點是為一線人員提供快速、精確、靈敏的檢疫方法。

關鍵詞：毛刺線蟲；傳毒種；專化性；鑒定技術

毛刺線蟲在世界大部分地區(qū)都有報道發(fā)生，并廣泛分布于歐洲、南、北美洲，通過直接取食或傳播植物病毒，嚴重危害多種栽培作物和野生植物[1]（見表1），其中傳播病毒造成損失遠遠大于線蟲本身取食造成危害，因此其作為傳毒線蟲引起了各國的重點關注。我國于2007年5月正式對外公布的進境植物檢疫性有害生物名單中，包含了所有的傳毒線蟲種類，其中就包括毛刺屬線蟲傳毒種。

1 毛刺屬線蟲傳毒種及其所傳病毒

Trudgill[2]提出了長針科線蟲作為病毒介體必須符合一系列標準：①病毒和線蟲的特征必須能夠準確的鑒定；②試驗表明誘餌植物組織為病毒侵染；③試驗中介體線蟲的種是唯一可能的介體。Brown等[3]根據(jù)Trudgill對已報道的毛刺線蟲或擬毛刺線蟲傳毒文獻進行的評價，發(fā)現(xiàn)40篇中，只有12篇完全符合標準，隨后提出用單個毛刺線蟲測定其傳毒的新方法，給評價毛刺線蟲傳毒提供了可行的方法，該方法完全符合Trudgill提出的標準。經過研究，Brown等[4]提出毛刺屬只有4種線蟲能夠傳毒，分別為：圓桶毛刺線蟲（Trichodorus cylindricus）、原始毛刺線蟲（T. primitivus）、具毒毛刺線蟲（T. viruliferus）、相似毛刺線蟲（T. similis）。

毛刺科線蟲傳播的病毒為煙草脆裂病毒屬（Tobravirus）病毒。煙草脆裂病毒屬病毒為桿狀粒體，共有3個確定種，其中草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）、豇豆早褐病毒（Pea early-browning virus，PEBV）兩種由毛刺屬線蟲傳播，辣椒環(huán)斑病毒（Pepper ringspot virus，PRV）由擬毛刺屬線蟲傳播[5～7]。

表1 毛刺屬線蟲傳毒種的地理分布和寄主范圍[10]Table 1 Geological distribution and host range of virus-vector ofTrichodorusnematodes

2 毛刺屬線蟲傳毒?；?/h2>

2.1 毛刺屬線蟲與所傳病毒的?；越M合

毛刺線蟲種與傳播的病毒種或株系之間具有高度的?；运剑蛇_到介體種的不同種群或微小差異的病毒血清型株系上的?；猿潭萚5,8～9]（見表2）。

表2 毛刺屬線蟲種與植物病毒間?；越M合[5]Table 2 Specificity ofTrichodorusspecies with plant viruses

2.2 毛刺屬線蟲的傳毒機理

毛刺線蟲所傳帶病毒被吸附在整個食道壁及食道和腸連接的瓣門上，但是在毛刺上沒有病毒粒體[10]。線蟲對病毒粒體的保留和釋放，有兩種假說：

電荷假說：線蟲的病毒保留位點和病毒粒體各帶有不同電荷，通過正負電荷吸引而使粒體保留在有效位點，一種病毒的不同株系可能表面帶有的電荷密度不同，就需要不同介體線蟲種來傳播；而不同病毒種如能由同一介體線蟲種傳播，則可能是因為病毒具有相似的電荷密度。據(jù)推測，病毒粒體的釋放可能是在線蟲取食時食道腔內的pH值發(fā)生變化，從而改變粒體表面電荷、釋放粒體[5～6]。

分子識別假說：毛刺線蟲食道內壁層上具有碳水化合物粘層，而病毒外殼蛋白(CP)可能具有類似凝集素的特性，二者之間存在分子識別關系而進行結合，病毒粒體的傳播可能依賴于病毒蛋白外殼的特性[5～6]。

2.3 毛刺屬線蟲傳毒?；缘姆肿訖C制

試驗表明，病毒基因組RNA-2片斷在線蟲傳播中起了重要作用[7]。RNA-2片斷編碼病毒外殼蛋白和1～3種非結構蛋白[11～12]。核磁共振研究表明，煙草脆裂病毒屬病毒外殼蛋白C一末端具有一突出粒體表面的片斷，可能與病毒粒體在介體內的保留位點起作用[5,13～14]。

原始毛刺線蟲可傳播PEBV-TpA56，但不能傳播PEBV-SP5株系。分析2個株系RNA-2編碼的3種分子量分別為9、29.6、23 ku的非結構蛋白發(fā)現(xiàn)，編碼29.6 ku蛋白的基因與線蟲傳播有關[15]。Macfarlane等[16]通過誘變試驗發(fā)現(xiàn)，PEBV-TpA56所有非結構基因可能都與線蟲介體傳播有關，Schmitt等[17]在隨后的誘變試驗中發(fā)現(xiàn)，23 ku基因不是線蟲傳播的必要條件，但影響線蟲傳播頻率。Macfarlane[13]的研究表明非結構蛋白基因還和線蟲傳播的專化性有關。

3 毛刺屬線蟲傳毒種鑒定的研究進展

3.1 形態(tài)學研究

3.1.1 毛刺屬的研究[10]由于毛刺科線蟲的雌雄蟲都具有豐富的形態(tài)分類特征，所以雌雄蟲的形態(tài)特征都被用于種屬的鑒定。毛刺屬雌蟲以生殖腺的單雙、受精囊的有無、陰道長度、陰道骨化結構的大小、陰道收縮肌的發(fā)達程度、陰門形態(tài)、陰門區(qū)側體孔的有無等分類特征，區(qū)分于毛刺科其他各屬。毛刺屬雄蟲的鑒定則主要根據(jù)交合傘的有無、蟲體后部的彎直、交合刺懸肌囊的發(fā)達程度、交配乳突數(shù)、交合刺形態(tài)及飾紋附屬物、縮回交合刺區(qū)內交配乳突數(shù)、頸乳突數(shù)、側頸孔數(shù)等特征。

3.1.2 毛刺屬4個傳毒種的形態(tài)學研究 Decraemer[10]對毛刺屬的種的鑒定特征進行了詳細描述，對4種傳毒毛

刺線蟲的雌雄蟲特征描述如下：

3.1.2.1 雌蟲特征

原始毛刺線蟲：陰道骨化結構桿狀，間距寬，平行于陰道腔；瘤針長28～57μm。

具毒毛刺線蟲：陰道骨化結構桿狀，但較短、近卵形，間距寬，平行于陰道腔；陰道長菱形；瘤針長28～57 μm。

相似毛刺線蟲：陰門橫裂；陰道長菱形；陰道骨化結構略小，不平行于體縱軸線，圓三角形，相距近；一個陰門后側體孔；瘤針長36～52μm。

圓筒毛刺線蟲：陰道桶形；陰道骨化結構中等大小，不平行于體縱軸線，三角形，其頂端指向陰門、傾斜；瘤針長35～52μm。

3.1.2.2 雄蟲特征

原始毛刺線蟲：有3個腹中頸乳突，瘤針區(qū)內有2個，第二個正好位于瘤針基部后；縮回交合刺區(qū)有1個腹中交配乳突；交合刺桿部的后半部非常細，交合刺中部的縊縮有時不清楚，剛毛有時不清楚，交合刺長32～54μm。

圖1 4種傳毒毛刺屬線蟲的雄蟲交合刺形態(tài)Figure 1 Spicule morphology of 4 maleTrichodorusnematodes

圖2 4種傳毒毛刺屬線蟲的雌蟲陰門及陰道骨化結構形態(tài)Figure 2 Vulva and vaginal sclerotization of 4 femaleTrichodorusnematodes

具毒毛刺線蟲：有3個腹中頸乳突，位于瘤針區(qū)內有2個，第二個正好位于瘤針基部后；縮回交合刺區(qū)無腹中交配乳突；交合刺較細，中間較短的有缺刻區(qū)，剛毛不明顯，交合刺長22～37μm；瘤針長32～53μm。

相似毛刺線蟲：有3個腹中頸乳突，位于瘤針區(qū)內有1個；交合刺有球形柄，粗，長30～44μm；瘤針長35～50μm。

圓筒毛刺線蟲：有3個腹中頸乳突，位于瘤針區(qū)內有1個；蟲體后部直，有交合傘；交合刺桿的后部膨大，交合刺無球形柄，長28～49μm。

3.2 毛刺屬線蟲傳毒種的分子鑒定

毛刺線蟲種的形態(tài)學鑒定，要求鑒定人員具有良好的分類學基礎。分子生物學在其它線蟲的鑒定中已得到廣泛應用[19～21]，但是在毛刺屬線蟲的鑒定中應用很少。Boutsika等[22]對來自兩個毛刺屬和擬毛刺屬的四個種（Paratrichodorus macrostylus, P. pachydermus, T. primitivus和T. similis）的rDNA序列特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)其18S和5.8S基因高度保守，相反的，ITS序列的變異度比較大。T. primitivus和T. similis的ITS序列長度分別為1537 bp和1 303 bp，是線蟲門中已報道最長的ITS序列，是擬毛刺屬兩個種的2～3倍，但是GC含量沒有顯著性差異。

在之后的研究中，Boutsika等[23]設計了針對P. macrostylus、P. pachydermus、T. primitivus和T. similes4個種的特異性引物，并成功運用單條成蟲的DNA完成了PCR擴增，獲得的PCR產物大小依次為：497、329、256、452 bp。傳毒線蟲種的特異性引物，結合該線蟲所傳播的TRV病毒株的特異性引物一并擴增，被用來檢測地塊傳播TRV病毒的可能性。

Holeva[24]設計了一套基于實時熒光PCR技術的檢測傳毒毛刺線蟲與其所傳病毒的方法。針對P. macrostylus、T. similis的18S基因分別設計了特異性引物和探針，同時分別針對TRV的RNA1、TRV-Ppk20和TRV-Tpo120毒株的RNA2設計了3對引物和探針，并成功完成了單一樣品的試驗；希望運用該方法通過對地塊土樣的檢測，快速、靈敏、準確獲得該地塊內線蟲病毒的種類、數(shù)量等分子信息，為該地塊的風險評估提供可靠的依據(jù)。

4 問題和展望

針對四種傳毒毛刺屬線蟲，無論是傳毒的分子機理，還是分子生物學鑒定，主要是由Brown等專家研究，但近幾年未有新的報道；其次關于T. primitivus和T. similis研究的相對較多，但對圓桶毛刺線蟲、具毒毛刺線蟲的研究幾乎為空白。針對T. primitivus和T. similis的特異性引物已有報道，但是同時檢測多種線蟲的PCR方法有待開發(fā)。Boutsika等[23]報道其設計的T. similis引物的PCR結果不穩(wěn)定，并懷疑所用的DNA提取方法不適用于T. similis，其提取方法有待改良。T. cylindricus、T. viruliferus的傳毒機理、傳毒?；缘姆肿訖C理等是否與T. primitivus、T. similis類似，有待進一步研究。作為檢疫部門，探索T. cylindricus、T. viruliferus是否也存在與T. primitivus、T. similis一樣變異度較大的ITS區(qū)，設計鑒定種的特異性引物，為一線人員提供快速、精確、靈敏的檢疫鑒定方法，是今后研究工作的重點。

參考文獻：

[1] Brown D J F. The transmission of two strains of strawberry latent ringspot virus by populations of Xiphinema diversicaudatum (Nematoda: Dorylaimoidea[J]. Nematol，1985（13）：217－223.

[2] Trudgill D L，Brown D J F. Mcnamara D G. Methods and criteria for assessing the transmission of plant viruses by longidorid nematodes[J]. Revue Nematol，1983，6（1）：133－141.

[3] Brown D J F，Ploeg A T，Robinson D J. A review of reported associations between Trichodorus and Paratrichodorus species (Nematoda：Trichodoridae) and tobraviruses with a description of laboratory methods for examining virus transmission by trichodorids[J]. Revue Nematol，1989，12（3）：235－241.

[4] Brown D J F，Halbrendt J M，Jones A T，et a1. An appraisal of some aspects of the ecology of nematode vectors of plant viruses[J]. Nematologia mediterraneum，1994（22）：253－263.

[5] Brown D J F, Robinson W M，Trudgill D L. Transmission of viruses by plant nematodes[J]. Annu Rev Phytopathol，1995（33）：226.

[6] Brown D J F，Weischer B.Specificity，exclusivity and complementarity in the transmission of plant viruses by plant parasitic nematodes：an annotated tern1inology[J]. Fundam Appl Nematol，1998（21）：1－11.

[7] Vassilakos N ,Macfarlane S A ,Weischer B，et a1. Exclusivity and complementarity in the association between nepo—and tobraviruses and their respective vector nematodes[J]. Med Fac Landbouww Univ Gent，1997（62）：713－720.

[8] Brown D J F，Ploeg A T，Robinson D J. The association between serotypes of tobraviruses and Trichodorus and Paratrichodorus species[J]. Bulletin OPPE／EPPO Bulletin，1989（19）：611－677.

[9] Ploeg A T，Asjes C J，Brown D J F. Tobacco rattle virus serotypes and associated nematode vector species of Trichodoridae in the bulb-growing areas in the Nether1ands[J]. Neth J PI Path，1991（97）：311－319.

[10] Decraemer W. The family Trichodofidae：stubby root and virus vector nematodes[M]. The Netherlands, Kluwer acdemic pubhshers，1995，27－31，77－337.

[11] Brown D J F，Trudgill D L，Robinson W M. Nepoviruses：transmission by nematodes[A]. HARRISON，MuRANT A F. The PIant Viruses（Vol 5）[M]. New York：Plenum Press，1996，187－209.

[12] Ploeg A T，Brown D J F，Robinson D J.The association between species of Trichodorus and Paratrichodorus vector nematodes and serotypes of tobacco rattle tobravirus[J]. Ann Appl Biol，1992，121：6l9－630.

[13] Macfarlane S A，Vassilakos N，Brown D J F. Similarities in the genome organization of tobacco rattle virus and pea early-browning virus isolates that are transmitted by the same vector nematode[J]. J Gen Virol，1999（80）：273－276.

[14] Mayo M A，Brierley K M，Goodman B A. Developments in the understanding of the particle structure of tobraviruses[J]. Biochemie，1993（75）：639－644.

[15] Macfarlane S A，Brown D J F. Sequence comparison of RNA2 of nematode-transmissible and nematode-non-transmissible isolates of pea early-browning virus suggests that the gene encoding the 29 kDa protein may be involved in nematode transmission[J]. J Gen Virol，1995（76）：1 299－1 304.

[16] Macfarlane S A，Wallis C A，Brown D J F. Multiple virus genes involved in the nematode transmission of pea early browning virus[J]. Virology，1996（219）：417－422.

[17] Schmitt C，Muetter A M ，Mooney A，et a1. Immunological detection and mutational analysis of the RNA2 encoded nematode transmission proteins of pea early browning virus[J]. J Gen Virol，1998（79）：1 281－1 288.

[18] Wilfrida DECRAEMER，Pierre BAUJARD. A polytomous key for the identification of species of the family Trichodoridae Thorne, 1935 (Nematoda: Triplonchida) [J]. Fundam Appl Nematol，1998，21（1）：37－62.

[19] Jones JT, Phillips MS, Armstrong MR. Molecular approaches in plant nematology[J]. Fundam Appl Nematol 1997（20）：1－14.

[20] Blok V C, Malloch G, Harrower B,et a1. Intraspecific variation in ribosomal DNA in populations of the potato cyst nematode Globodera pallida[J]. J Nematology，1998（30）：262－274.

[21] Vrain TC, Wakarchuk DA, Levesque AC,et a1. Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group[J]. Fundam Appl Nematol，1992（15）：563－573.

[22] Boutsika K, Phillips M S, MacFarlane S A,et a1. Molecular diagnostics of trichodorid nematodes and their associated Tobacco rattle virus (TRV) [J]. Plant Pathol，2003（53）：110－116.

[23] K Boutsika, DJF Brown, M Phillips,et a1. Molecular characterisation of the ribosomal DNA ofParatrichodorus macrostylus,P. pachydermus,Trichodorus primitivusandT. similis(Nematoda: Trichodoridae) [J]. Nematology，2004，6（5）：641－654.

[24] R. Holeva, M.S. Phillips, R. Neilson，et a1. Real-time PCR detection and quantification of vector trichodorid nematodes and Tobacco rattle virus[J]. Molec Cel Probes，2006（20）：203－211.

中圖分類號：S154.38＋6

文獻標識碼：A

文章編號：1001-3776（2010）04-0094-05

收稿日期：2010-03-10；修回日期：2010-05-05

基金項目：國家“十一五”重大科技支撐計劃“農林重大生物災害防控技術研究”項目“潛在入侵物種口岸偵測技術”（2006BAD08A13）

作者簡介：陳吳?。?983－），男，浙江仙居人，碩士，從事植物檢疫研究。

Research Advances on Virus-vector of Trichodorus Nematodes

CHEN Wu-jian，WU Rong，LIN Xiao-jia
（Zhejiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310012, China）

Abstract:Presentation was made on virus-vector types of four species ofTrichodorus, likeT. cylindricus,T. primitivus,T. viruliferusandT. similis. The research advances were summarized on virus-vector specificity of transmission, morphological and molecular identification for vector Trichodorus species. The future research will be focused at quick, precise and sensitive method for quanrantine.

Key words:Trichodorusnematodes; virus-vector; specificity; identification