西南樺遺傳多樣性研究

董 蔚，黃壽先，陳 榮，桂仁意

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004）

西南樺遺傳多樣性研究

董 蔚1，黃壽先2，陳 榮1，桂仁意1

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2. 廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004）

摘要：采用改良CATB法對(duì)采自云南大青山、平果等9個(gè)天然分布區(qū)的150個(gè)西南樺（Betula alnoides）樣品進(jìn)行DNA提取，獲得了較高質(zhì)量的DNA，然后利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，建立了適用于西南樺的AFLP反應(yīng)體系；選擇5對(duì)AFLP引物，對(duì)150個(gè)西南樺樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出158個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)115個(gè)，占72.8%，每對(duì)引物獲得20～55個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性比例為50.0%～84.0%。通過(guò)對(duì)西南樺的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：在種間個(gè)體水平上，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為76.58%～93.04%，平均為83.8%；在群居水平上，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為72.80%?？梢?jiàn)西南樺天然居群內(nèi)的變異大于居群間的變異；由Nei’s遺傳距離分析得出，西南樺大部分居群間還是存在一定的遺傳距離，其中最大在東蘭和靖南之間，為0.020 1。

關(guān)鍵詞：西南樺；遺傳多樣性；分子標(biāo)記；AFLP；多態(tài)性

西南樺（Betula alnoides）為樺木科樺木屬在北半球分布最南的一個(gè)種，集中分布在云南、廣西和貴州南部地區(qū)，該分布區(qū)與越南、老撾和緬甸的分布區(qū)連成一片，形成西南樺中心分布區(qū)，垂直海拔200～2 800 m[1～2]。西南樺為強(qiáng)陽(yáng)性樹(shù)種，喜光，不耐蔭蔽，適生于酸性土壤，具一定的耐貧瘠能力。西南樺生長(zhǎng)迅速，是繼桉樹(shù)后又一優(yōu)良速生珍貴樹(shù)種，與陰性或中性偏蔭樹(shù)種紅椎、木荷、樟樹(shù)等混交成林，不僅生長(zhǎng)好而且林分結(jié)構(gòu)好，防護(hù)性能強(qiáng)，生態(tài)效果好[3～5]。

西南樺生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，屬旱季落葉樹(shù)種，保持水土能力強(qiáng)；林內(nèi)VA菌等微生物可改良土壤，為改造熱帶、亞熱帶地區(qū)生態(tài)公益林的理想樹(shù)種。西南樺樹(shù)干通直圓滿，木材密度適中、紋理優(yōu)美、不翹不裂極易于加工，被廣泛應(yīng)用于高級(jí)建筑裝飾及高檔家具制作。在廣西百色，西南樺原木山場(chǎng)價(jià)便高達(dá)1 700元/m3。西南樺樹(shù)汁營(yíng)養(yǎng)豐富，可開(kāi)發(fā)樺樹(shù)汁作為飲料；樹(shù)皮鞣質(zhì)含量為7.0%～11.6%，可用于提制栲膠[3～4]。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南大青山、平果等9個(gè)西南樺天然分布區(qū)采集樣本，每個(gè)樣本間隔50 m以上，挑選新鮮無(wú)病蟲(chóng)害完整葉片放入封口袋中，加變性硅膠干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室常溫保存[6～7]。共采集9個(gè)居群150個(gè)單株（表1）。

表1 西南樺采樣情況Table 1 Sampling ofB. alnoides

1.2 方法

1.2.1 模板制備 參照李志真等[8]的改良CTAB法抽提基因組DNA，使用紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并稀釋到100 ng/μL備用。

1.2.2 AFLP分析 參照Vos等[9]的方法進(jìn)行AFLP試驗(yàn)?；蚪MDNA用EcoRI和MseI雙酶后，進(jìn)行相應(yīng)的接頭連接，使用帶一個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)，預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍作為選擴(kuò)模板。經(jīng)引物篩選，以擴(kuò)增條帶數(shù)目適中、多態(tài)位點(diǎn)比例高的5對(duì)引物組合（表2）進(jìn)行選擴(kuò)，并用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳并銀染顯帶。

表2 引物組合選擇及序列Table 2 Selection of primer combination and the sequence

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結(jié)果，讀取100～800 bp中清晰的條帶，將每個(gè)條帶視為一個(gè)位點(diǎn)，有帶記為“1”，無(wú)帶計(jì)為“0”，建立二元數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。用AFLP_SURV1.0分析軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)Nei等[10]計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。

式中，GS為遺傳相似系數(shù)，Nij為個(gè)體i和j的共有位點(diǎn)，Ni＋Nj為總位點(diǎn)數(shù)，GD為遺傳距離，當(dāng)GD為1時(shí)表明遺傳距離最遠(yuǎn)，當(dāng)GD為0時(shí)表明遺傳關(guān)系最近。

表3 擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of AFLP amplified

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

選用的5對(duì)引物組合共擴(kuò)增出158條清晰有效條帶，每對(duì)引物的擴(kuò)增信息見(jiàn)表3。根據(jù)這158條AFLP標(biāo)記條帶進(jìn)行西南樺的遺傳多樣性分析，各居群間多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率以及基因多樣性見(jiàn)表4。

從表4可以看出，云南西南樺各居群內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)百分率為76.58%～93.04%，F(xiàn)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率最低，為76.58%，I居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率最高，為93.04%，9個(gè)居群多態(tài)位點(diǎn)百分率平均為83.8%。根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)百分率大小對(duì)9個(gè)西南樺居群進(jìn)行排序?yàn)椋篒 > G > C > A > B > D > E > H > F。

表4 西南樺群居遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of communities ofB. alnoides

Nei’s基因多樣性分析結(jié)果則在0.209 8～0.284 0，F(xiàn)居群最低為0.209 8，I居群最高為0.284 0。9個(gè)居群Nei’s基因多樣性分析結(jié)果由大到小排序?yàn)椋篒 > C > G > A > B > D > H > E > F。

表5 Nei’s遺傳距離Table 5 Nei’s genetic distance

在群居水平上，多態(tài)性位點(diǎn)共115個(gè)，占72.80%。由此可見(jiàn)，西南樺在群居間的遺傳多樣性低于居群內(nèi)的遺傳多樣性，具一定的地域遺傳變異。Nei’s基因多樣性分析結(jié)果為0.244 2，為居群內(nèi)數(shù)值的平均值。

2.2 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

9個(gè)西南樺天然群體遺傳距離見(jiàn)表5，大青山與靖南、田林，平果與田林、東蘭，那坡與靖南、田林，天峨與東蘭，靖南與東蘭之間的遺傳距離均超過(guò)了0.010 0，其中靖南與東蘭遺傳距離最大，為0.020 1。

3 討論

由于西南樺天然林分布區(qū)地理位置偏僻，分布面積廣，樣品采集困難[11]；并且樺木屬植物中富含多糖和多酚類物質(zhì)，不利于DNA提取[8]；同時(shí)，從分子水平對(duì)西南樺遺傳多樣性進(jìn)行分析尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)通過(guò)AFLP分子標(biāo)記對(duì)廣西區(qū)西南樺天然林進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，9個(gè)天然群體多態(tài)位點(diǎn)百分率為76.58%～93.04%，平均值為84.05%，明顯高于居群間水平，同時(shí)群體內(nèi)的遺傳多樣性和基因多樣性也高于群體間水平。說(shuō)明西南樺遺傳多樣性豐富，且不同天然分布區(qū)之間遺傳變異不大。

西南樺的居群內(nèi)的遺傳多樣性較居群間水平豐富，可能有以下幾個(gè)原因引起：①曾杰等[11～12]認(rèn)為盡管由于不適宜生境的阻隔以及森林破碎化導(dǎo)致西南樺居群之間存在一定程度的隔離，但它們是風(fēng)媒植物，相互之間仍然存在較強(qiáng)的基因流，從而減少了遺傳漂變；②根據(jù)葛錦芳等[13]的推測(cè)，廣西壯族自治區(qū)的西南樺是從云南沿著南盤(pán)江擴(kuò)散而來(lái)，居群分化的歷史較短，所以居群間分化較小；③西南樺的大規(guī)模采伐始于20世紀(jì)80年代，由于時(shí)間較短，所導(dǎo)致的生境破碎化對(duì)西南樺天然居群的遺傳變異尚無(wú)顯著影響；④本研究的調(diào)查范圍僅限于廣西壯族自治區(qū)，而且西南樺只在其西南部、西部和西北部有分布，其經(jīng)度、緯度和海拔跨度較小。

西南樺遺傳多樣性的研究對(duì)開(kāi)展其良種選育、種質(zhì)資源保存以及天然林防護(hù)和經(jīng)營(yíng)具有重要意義[11～12]。因此，應(yīng)加強(qiáng)現(xiàn)有群體的遺傳多樣性保護(hù)及基因交流，以防遺傳多樣性縮小或喪失。同時(shí)，挑選基因多樣性高的居群作為遺傳資源收集與保存。西南樺分布較為廣泛，有效保護(hù)和合理經(jīng)營(yíng)遺傳多樣性豐富的居群有助于適應(yīng)環(huán)境變化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 曾杰，鄭海水，翁啟杰. 我國(guó)西南樺的地理分布與適生條件[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，1999，12（5）：479－484.

[2] 曾杰. 我國(guó)西南樺研究的回顧與展望[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（3）：379－384.

[3] 王衛(wèi)斌. 西南樺生物學(xué)特性及發(fā)展前景[J]. 福建林業(yè)科技，2005，12（32）：177－178.

[4] 陳朝飛，陳安. 西南樺的生物學(xué)生態(tài)學(xué)特性及其在我省的引種現(xiàn)狀[J]. 廣東林業(yè)，2003，19（1）：15－17.

[5] 馬克平. 試論生物多樣性的概念[J]. 生物多樣性，1993，1（1）：20－22.

[6] 張國(guó)防，陳存及，邢建宏. 樟樹(shù)干葉DNA提取方法的研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（1）：111－11.

[7] Chase MW, Hills HH, Silica Gel. An Ideal Material for Field Preservation of Leaf Samples for DNA Studies[J]. Taxon，1991，40（5）：215－220.

[8] 李志真，黃勇，謝一青，等. 不同保存方法對(duì)光皮樺總DNA提取效果的影響[J]. 分子植物育種，2006，4（1）：131－134.

[9] Vos P，hogers M，Reijans T，et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Res，1995，23（21）：4 407－4 414.

[10] Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1979，76（10）：5269－5273.

[11] 曾杰，王中仁，周世良，等. 廣西西南樺天然居群遺傳多樣性的研究[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，27（1）：66－72.

[12] 曾杰，鄭海水，甘四明，等. 廣西西南樺天然居群的表型變異[J]. 林業(yè)科學(xué)，2005，41（2）：59－64.

[13] 葛錦芳. 云南樺木科植物的分類與地理分布[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，1985（1）：1－9.

中圖分類號(hào)：S792.159

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-3776（2010）04-0050-03

收稿日期：2010-03-10；修回日期：2010-05-05

基金項(xiàng)目：廣西大學(xué)中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究課題“廣西區(qū)西南樺遺傳多樣性研究”（KF(2004)-004）

作者簡(jiǎn)介：董蔚（1984－），男，浙江臨安人，碩士，從事林木生物技術(shù)研究。

Research on Genetic Diversity of Betula alnoides

DONG Wei1，HUANG Shou-xian2，CHEN Rong1，GUI Ren-yi1
（1. State Key Laboratory Cultivation Base of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Forestry College, Guangxi University, Nanning 530004, China）

Abstract:Extraction of DNA was conducted by improved CATB from 150 samples ofBetula alnoidesat 9 natural communities in Daqingshan, Pingguo, etc. Yunnan province. And AFLP reaction system was established by AFLP molecular marker. Five EcoRI/MseI primer combinations were selected and amplified 158 clear bands, among them 115 bands of polymorphic, taking 72.8%. Each primer enzyme mix amplified 20-55 bands, 50.0%-84.0% of them polymorphic bands. Analysis on genetic diversity showed that interspecific percentage of polymorphic loci was 76.58%-93.04%, average 84.05%, community percentage of polymorphic loci was 72.80%, indicating that more variation in community than that among communities. Analysis of Nei’s showed that there is significant genetic distance among most natural communities ofB. alnoides. The biggest is 0.0201 between Donglan and Jingnan.

Key words:Betula alnoides; genetic diversity; molecular marker; AFLP; polymophic