菠蘿皮發(fā)酵生產飼料蛋白優(yōu)良菌種的篩選

廣東海洋大學食品科技學院 黃 和 王 玲 陳仰真

菠蘿是我國南方栽培面積較大，產量較多的典型熱帶水果之一。據統(tǒng)計，我國每年菠蘿產量約200萬噸。由于新鮮菠蘿果實不易貯存，除少部分直接鮮銷外，大部分被加工成罐頭、果汁、果醬、果酒等產品。在這些菠蘿產品的加工過程中，占全果重的50%～60%的菠蘿果實加工副產物——果皮渣通常被加工廠直接丟棄，既浪費了資源，又造成一定程度的環(huán)境污染。資料表明，菠蘿皮渣中的水分、總酸和總糖等含量與果肉相差無幾，粗蛋白質和灰分的含量還高于果肉，分別是后者的2.5倍和 3.0 倍（Sanchaisurinya 和 Thammabut，1994）；另外，菠蘿皮中還富含適合微生物生長的纖維素等碳源物質。

本研究以菠蘿皮為原料，烘干粉碎后按一定比例加入麩皮等輔料，分別接種單一霉菌、酵母菌以及霉菌與酵母菌混合菌種發(fā)酵生產高產蛋白飼料，對各發(fā)酵條件下所得的產品的蛋白質含量、感官指標等進行了考核，以期獲得理想的高產蛋白菠蘿皮渣發(fā)酵菌種，為菠蘿皮渣高效發(fā)酵生產飼料蛋白提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 菠蘿皮渣：取自廣東湛江鷹峰食品有限公司菠蘿罐頭加工車間。取回后于80℃烘干粉碎備用，研究時按以下配方做成培養(yǎng)基：菠蘿皮渣（干粉）74%，麩皮 20%，（NH）2SO43%，尿素 2%，KH2PO41%，料水比為 1∶1，自然 pH 值。

菌種：白地霉、產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、扣蘘擬內孢霉、黑曲霉、綠色木霉2、綠色木霉1，對應的代號為 1、3、4、5、6、7、8， 購自廣東省微生物所；菠蘿皮發(fā)酵篩選酵母、菠蘿皮發(fā)酵篩選霉菌1、菠蘿皮發(fā)酵篩選霉菌 2，對應的代號為 2，9，10，是由本實驗室篩選得到的，未經過鑒定。

1.2 主要藥品及試劑 尿素、（NH）2SO4、KH2PO4、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 主要儀器和設備 鼓風干燥箱、組織粉碎機、恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、分光光度計等。

1.4 分析檢驗方法 水分含量的測定：常壓干燥法（GB/T 5009.3-2003）；灰分的測定：灰化法（GB/T 5009.4-2003）；粗脂肪的測定：索式抽提法（GB/T 5009.6-2003）；粗纖維的測定：酸堿洗滌法（GB/T 5009.10-2003）； 還原糖的測定：3，5-二硝基水楊酸法，大連輕工業(yè)學院（1994）；纖維素酶酶活的測定方法：分光光度法（NY/T 912-2004）；原料粗蛋白質的測定：飼料中粗蛋白質測定方法（GB/T 6432-1994）；發(fā)酵產物粗蛋白質含量的測定：飼料中粗蛋白質測定方法（GB/T 6432-1994）；發(fā)酵產物水洗含氮化合物后粗蛋白質（簡稱水洗蛋白）含量的測定：飼料酵母中水洗蛋白測定方法（QB/T 1940-1994）。

1.5 研究方法

1.5.1 單一菌種篩選試驗 按1.1中的配方配制培養(yǎng)基（以下同），以5%的接種量分別接入單一霉菌和酵母菌的擴大培養(yǎng)液，在28℃下霉菌培養(yǎng)108 h，酵母菌培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)物在80℃烘干后分別測定粗蛋白質含量、水洗蛋白含量，預選出蛋白質含量較高的酵母和霉菌。

1.5.2 混合菌種篩選試驗 將1.5.1方法選出的酵母和霉菌分別以不同的組合按1∶1的比例、5%的總接種量接入培養(yǎng)基中，進行雙菌種混合發(fā)酵，28℃培養(yǎng)108 h后，測定蛋白質含量并進行感官評價，選出產物蛋白質含量高的組合為最優(yōu)組合。

1.5.3 混合菌種的接種比例和接種量的確定 將混合菌種發(fā)酵所選出的產物蛋白質含量最高的組合分別按不同的接種比例、不同的接種量進行混合菌種發(fā)酵試驗，28℃培養(yǎng)108 h后，測定蛋白質含量并進行感官評價，最終確定理想的發(fā)酵菌種的接種比例和接種量。

2 結果與分析

2.1 單一菌種篩選試驗 用10株不同的霉菌和酵母菌株進行單一菌種發(fā)酵試驗，測定各發(fā)酵產物的粗蛋白質含量及水洗蛋白含量，結果見表1。

由表1可知：發(fā)酵產物的粗蛋白質含量高的，水洗蛋白含量不一定高，這是因為各種微生物對含氮化合物的利用情況各不相同。在選取優(yōu)良菌種時，應選擇對含氮化合物利用較好的菌種。對于發(fā)酵后的菠蘿皮飼料蛋白，應以水洗去除含氮化合物后測得的粗蛋白質含量比直接測得的粗蛋白質含量作為標準比較合理。因為水洗去銨態(tài)氮等含氮化合物后再檢測蛋白質，雖會同時洗去部分氨基酸和水溶性蛋白，但所得結果能較客觀地反映出發(fā)酵產物中的粗蛋白質含量，有效地避免培養(yǎng)基中微生物未利用的含氮化合物對蛋白質測定的影響。對表1中的單一菌種發(fā)酵后的產物蛋白質含量進行比較，發(fā)酵產物水洗后蛋白質含量較高的5株菌種依次為：黑曲霉，綠色木霉2，白地霉，菠蘿皮篩選酵母，產朊假絲酵母。由于菠蘿皮篩選酵母發(fā)酵所得的產物中的蛋白質含量無明顯優(yōu)勢，菌種還未經鑒定，所以該菌種暫時不予以采用，而選用其他四種菌作為混菌發(fā)酵的出發(fā)菌種。

表1 單一菌種發(fā)酵后產物的蛋白質含量 %

2.2 霉菌纖維素酶活力的測定 菠蘿皮含有相當數(shù)量的纖維素，霉菌能分泌纖維素酶來分解纖維素使之轉化為各種糖類物質，供給酵母合成蛋白質等營養(yǎng)物質。所以測定霉菌纖維素酶活力能夠更好地確定菌種分解纖維素的能力。為此，對本研究所采用的6株霉菌按照NY/T 912-2004和劉德海（2002）的方法進行羧甲基纖維素酶活力的測定，以保證所選的霉菌具有強的纖維素分解能力。纖維素酶活力測定的標準曲線見圖1，6株霉菌纖維素酶活力的測定見表2。

由表2可知，6株霉菌中綠色木霉2和黑曲霉比其他菌有非常明顯的羧甲基纖維素酶活力，這與表1的結果是相吻合的。也就是纖維素酶活力強的霉菌，其發(fā)酵后產物的蛋白質含量也高。

2.3 混合菌種篩選試驗 將單菌發(fā)酵試驗中選出的4株發(fā)酵產物蛋白質含量較高的菌株，即綠色木霉2、黑曲霉、白地霉、產朊假絲酵母經過不同雙菌種組合按1∶1的比例進行混合發(fā)酵試驗，其組合方式和發(fā)酵結果見表3。

圖1 纖維素酶活力測定標準曲線

表2 纖維素酶活力

從表3可看出，霉菌與酵母菌組合雙菌發(fā)酵產物的水洗蛋白含量明顯高于對照組的單菌發(fā)酵，這個結果也與郭維烈等（2002）報道的霉菌與酵母菌組合發(fā)酵可以提高菌體蛋白飼料的生產效率相吻合。其中，產朊假絲酵母和綠色木霉這個組合的發(fā)酵產物蛋白質含量比較高?？梢猿醪秸J為是理想的發(fā)酵菌種組合。

表3 混合菌種組合方式和發(fā)酵產物蛋白質含量 %

為進一步判斷各種菌種不同組合的發(fā)酵效果，通過觀察各菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況來考察發(fā)酵產物的外觀，結果見表4。

在培養(yǎng)24 h后，白地霉+綠色木霉2和產朊假絲酵母+黑曲霉組合有白色少量菌絲，白地霉+綠色木霉2和產朊假絲酵母+綠色木霉2組合則沒有變化，48 h后白地霉+黑曲霉和產朊假絲酵母+黑曲霉布滿白色菌絲，白地霉+綠色木霉2和產朊假絲酵母+綠色木霉2也有部分白色菌絲出現(xiàn)，在培養(yǎng)108 h之后，產朊假絲酵母+綠色木霉2組合培養(yǎng)基布滿了白綠色菌體且色澤均勻，白地霉+綠色木霉2組合培養(yǎng)基也分布了少量白色菌體但色澤不均勻，白地霉+黑曲霉和產朊假絲酵母+黑曲霉組合培養(yǎng)基因被黑色菌體覆蓋而略呈黑色。

表4 混合菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況

烘干粉碎后產朊假絲酵母+綠色木霉2組合的發(fā)酵產物有氣味芳香，白地霉+綠色木霉2還有原菠蘿皮味，白地霉+黑曲霉和產朊假絲酵母+黑曲霉組合雖氣味芳香但嗆鼻且顏色太黑。

綜合前面所述的發(fā)酵產物的蛋白質含量和各菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況及烘干粉碎后的感官評價，可以認為產朊假絲酵母+綠色木霉2是最佳菌種組合。

2.4 最佳菌種組合接種比例的確定 為研究最佳菌種組合的使用比例，用上述試驗所選出的菌種組合，將產朊假絲酵母和綠色木霉2分別按1∶5（0.2）、1∶2（0.5）、1∶1（1.0）、3∶2（1.5）、2∶1（2.0）、3∶1（3.0）、5∶1（5.0）、7∶1（7.0）的接種比例以5%的接種量接種后進行發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵產物的蛋白質含量，結果見圖2。

圖2 不同接種比例對產物蛋白含量的影響

由圖2可以看出，在產朊假絲酵母∶綠色木霉2接種比例小于 3∶2（1.5）時，粗蛋白質和水洗蛋白的含量隨著兩者比例的增大而升高，但當兩者接種比例大于1.5即大于3∶2后，粗蛋白質和水洗蛋白的含量逐漸下降，由此可以認為：產朊假絲酵母對發(fā)酵產物中蛋白質含量的影響較綠色木霉的影響大。原因是酵母利用了發(fā)酵原料中較多的糖分和無機鹽后在短時間內合成了蛋白質。但在發(fā)酵過程中，木霉的作用也是必不可少的，因為它可分泌大量的纖維素酶，使菠蘿皮中的纖維素分解后轉化成糖類物質，為酵母的生長繁殖提供必要的碳源和能量，并為蛋白質的合成提供充足的物質基礎；從感官狀態(tài)看，在不同菌種比例的發(fā)酵產物中，產朊假絲酵母∶綠色木霉2的接種比例為3∶2時發(fā)酵產物具有濃郁的香味，色澤淡黃。但當綠色木霉2接種比例增大時，發(fā)酵產物有明顯的霉味，色澤會變綠。因此，產朊假絲酵母∶綠色木霉以3∶2的比例進行組合，發(fā)酵產物的蛋白質含量及感官評價最好。

2.5 混合菌種最佳接種量的確定 將產朊假絲酵母C+綠色木霉L以3∶2的比例分別按2%、5%、10%、15%、20%的總接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵實驗，其蛋白質含量見圖3。

圖3 不同接種量對發(fā)酵產物蛋白含量的影響

由圖3可知，在接種量小于5%時，隨著接種量的增多，粗蛋白質和水洗蛋白含量逐漸增加，當接種量超過5%以后，兩種蛋白質含量都不再增加，曲線在平緩中略有下降。所以，最佳接種量為5%。

2.6 菠蘿皮發(fā)酵前后的蛋白含量及感官評價見表5。

從表5可看出，經過產朊假絲酵母和綠色木霉2混合發(fā)酵后的菠蘿皮發(fā)酵產物，粗蛋白含量提高了，為24.71%，水洗粗蛋白含量也達到了16.96%，產品具有濃郁的酵母甜香味。根據國家標準（QB/T 1940-1994），動物飼料蛋白要求粗蛋白質含量大于20%，因此，本研究所得的菠蘿皮發(fā)酵產物適于做動物蛋白飼料。

表5 菠蘿皮發(fā)酵前后的蛋白質含量及感官評價

3 結論

以菠蘿皮為原料，經烘干粉碎后添加麩皮20%、（NH）2SO43%、尿素 2%，KH2PO41%作為培養(yǎng)基發(fā)酵生產飼料蛋白，產朊假絲酵母和綠色木霉是理想的發(fā)酵菌種，將兩者以3∶2的比例、總接種量為5%等條件進行發(fā)酵后，菠蘿皮干粉中的粗蛋白質含量從原來的4.98%提高到24.71%，水洗去含氮物質后粗蛋白質含量提高到16.96%。達到了國家動物飼料蛋白含量的要求。菠蘿皮發(fā)酵后所得的飼料產品氣味芳香，適口性好。

[1]GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測定方法[M].北京：中國標準出版社，1994.

[2]NY/T912-2004.飼料添加劑.纖維素酶活力的測定[M].北京：中國標準出版社，2004.

[3]QB/T1940-1994.飼料酵母[M].北京：中國標準出版社，1994.

[4]大連輕工業(yè)學院，華南理工大學.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1994.

[5]郭維烈，郭慶華，謝小寶，等.4320菌體蛋白飼料中雙菌作用機制的研究[J].農業(yè)工程學報，2002，18（1）：122 ～125.

[6]劉德海.纖維素酶酶活的測定方法[J].中國飼料，2002，17：27～30.

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