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    五步蛇毒抗腫瘤組分X對(duì)小鼠生殖毒性及F1子代的影響

    2010-04-24 10:53:20逄朝霞魯文清翟瑞仁郭廷凱
    實(shí)用醫(yī)藥雜志 2010年3期
    關(guān)鍵詞:雄鼠雌鼠交配

    逄朝霞,魯文清,翟瑞仁,郭廷凱

    蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白,成分復(fù)雜,主要含蛋白質(zhì)、多肽及一些酶類(lèi),具有廣泛的生物學(xué)活性,可作為天然的藥用資源。在抗腫瘤方面很有潛力[1],然而蛇毒中含有多種復(fù)雜成分,這些成分可能會(huì)引起臨床不良反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)將提取的五步蛇毒抗腫瘤組分X(FX)按照低劑量組為2.5 mg/kg,中劑量組為5 mg/kg,高劑量組為10 mg/kg;第4組為生理鹽水陰性對(duì)照組(CK),經(jīng)尾靜脈注入鼠體,通過(guò)觀察五步蛇毒抗腫瘤組分X對(duì)雄鼠、孕鼠一般生殖毒性、圍產(chǎn)期毒性的影響,提示,五步蛇毒抗腫瘤組分X在5 mg/kg劑量下應(yīng)用于臨床是安全的?,F(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料 五步蛇(Agkistrodon Acutus)蛇毒凍干粉,遼寧省清源縣,DEAE-sepharose瓊脂糖凝膠,瑞典Pharmacia公司。性成熟昆明種小鼠,體重(35±2)g,未交配過(guò),由中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.2 方法

    1.2.1 蛇毒抗腫瘤組分X的分離純化 DEAESepharose離子交換色譜:稱(chēng)取五步蛇毒凍干粉20 g,用0.02 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液溶解。溶液以離心半徑8 cm 4 000 r/min離心20 min,取上清,透析12 h后,以6.0 ml/min的流速上陰離子交換柱(DEAE-Sepharose)。上樣完畢后以0.02 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液洗脫未吸附的雜蛋白,待透過(guò)峰下到基線時(shí),分別用0.02 mol/L Tris-HCl含0.05 mol/L和0.1 mol/L氯化鈉的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫收集活性峰。

    1.2.2 一般生殖毒性實(shí)驗(yàn)[3]①分組與給藥:選狀態(tài)良好、發(fā)育正常的雄性小鼠120只,雌性120只,分別將雌雄小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組,雄性4組,每組30只,雌性4組,每組30只;給藥劑量參考一般毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4],低劑量組為 2.5 mg/kg,中劑量組為5 mg/kg,高劑量組為10 mg/kg,第4組為生理鹽水陰性對(duì)照組(CK);雄性小鼠交配前連續(xù)尾靜脈給藥60 d,雌性小鼠交配前連續(xù)尾靜脈給藥14 d,按雌雄1∶1合籠交配,觀察陰栓的有無(wú)確定是否有交配行為,有交配行為的雌鼠當(dāng)天定為妊娠d0,妊娠時(shí)間相同或相近的雌鼠分成一組,每組25只,共4組;對(duì)雌孕鼠繼續(xù)給藥至妊娠第15天;稱(chēng)體重1次/3 d,給藥量0.1 ml/只小鼠,根據(jù)體重變化調(diào)整;②觀察指標(biāo):對(duì)于雌鼠,一般綜合指標(biāo)包括測(cè)定動(dòng)物用藥期間體重和進(jìn)食量,觀察精神狀態(tài)和活動(dòng)情況,稱(chēng)體重1次/周,觀察交配行為,計(jì)算受孕率等;對(duì)于雄鼠,測(cè)定動(dòng)物用藥期間體重和進(jìn)食量,觀察精神狀態(tài)和活動(dòng)情況,交配后處死,檢查精子活動(dòng)度、精子數(shù)量和精子形態(tài),稱(chēng)睪丸和附睪重量,計(jì)算重量系數(shù),對(duì)睪丸組織進(jìn)行病理檢查;在妊娠第18天處死動(dòng)物并剖腹,計(jì)算受孕率,死胎數(shù)、活胎數(shù)、總著床數(shù)、吸收胎數(shù)、有死胎孕鼠數(shù)、子宮連胎重和孕0~14 d母鼠增重,觀察活胎的外形,記錄外形畸變率,對(duì)隨機(jī)抽出的2/3胎仔用茜素紅染色后做骨髓檢查,記錄骨髓畸變率,其余1/3胎仔經(jīng)Bouin液固定后用徒手切片法檢查內(nèi)臟缺陷,包括肝、心、肺、腎、腦、睪丸、卵巢、子宮等臟器,記錄內(nèi)臟畸變率并計(jì)算總畸形率。

    1.2.3 圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)[4]①分組與投藥:選狀態(tài)良好、發(fā)育正常的雄性小鼠120只,雌性120只,分別將雌雄小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組,雄性4組,每組30只,雌性4組,每組30只;給藥劑量參考一般毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)低劑量組為2.5 mg/kg,中劑量組為5 mg/kg,高劑量組為10 mg/kg,第4組為生理鹽水陰性對(duì)照組(CK);按雌雄1∶1合籠交配,觀察陰栓的有無(wú)確定是否有交配行為,有交配行為的雌鼠當(dāng)天定為妊娠d0,妊娠時(shí)間相同或相近的雌鼠分成一組,每組25只,共4組;從妊娠第15天開(kāi)始每天用藥直至分娩后21 d;②觀察指標(biāo):孕鼠分娩后第7天每窩保留8只仔鼠,不足8只棄去,分別于產(chǎn)后第1、4、8、12、16、21天稱(chēng)重; 仔鼠出生后第5天測(cè)試以下指標(biāo):翻正反身:記錄仔鼠腹面朝上轉(zhuǎn)為四肢著地所需的時(shí)間,記錄≤10 s和>10 s的仔鼠數(shù);陰性趨地性試驗(yàn):仔鼠放在傾斜25°斜面上,頭部向下,仔鼠會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)向使其頭朝上,觀察頭部轉(zhuǎn)向180°所需時(shí)間 ,以大于和小于20 s為界,記錄仔鼠數(shù);斷崖回避試驗(yàn):將仔鼠頭部置于臺(tái)面外,觀測(cè)仔鼠鼻尖退回臺(tái)邊緣所需時(shí)間,記錄大于和小于20 s的仔鼠數(shù);游泳能力試驗(yàn):用仔鼠游泳試驗(yàn)檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況,仔鼠放入26℃水中游泳15 s,記錄直線游動(dòng)、圓圈游動(dòng)、浮在水面及下沉的仔鼠數(shù)。

    隨機(jī)取產(chǎn)后2個(gè)月F1代仔鼠雌雄各10只進(jìn)行隨機(jī)交配試驗(yàn),觀察F1代雌鼠的受孕率和胚胎發(fā)育情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,各組觀察指標(biāo)求出±s,組間比較用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1 一般生殖毒性實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 雄鼠 各組動(dòng)物用藥期間精神狀態(tài)良好,尿、大便和皮毛未因長(zhǎng)期用藥而發(fā)生變化,飲水量和食物消耗量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組體重增長(zhǎng)值分別為:(9.21±2.38)、(9.40±3.12)、(9.01±1.92)、(6.93±1.87)g,給藥期間,高劑量組體重增長(zhǎng)受到限制,說(shuō)明高劑量組雄鼠已產(chǎn)生毒性反應(yīng),高劑量組雄鼠睪丸系數(shù)與CK組比較有增加,但病理檢查未見(jiàn)退變及壞死等病理反應(yīng),可認(rèn)為睪丸系數(shù)的相對(duì)增加主要是由于體重減少,造成睪丸質(zhì)量相對(duì)增加所致。精子量、精子活動(dòng)度、交配頻度和雄鼠的生育率未見(jiàn)明顯差異。

    2.1.2 雌鼠 試驗(yàn)期間各組動(dòng)物精神狀態(tài)良好,尿、大便和皮毛未因長(zhǎng)期用藥而發(fā)生變化,飲水量和食物消耗量與對(duì)照組無(wú)明顯差別,受孕率也未見(jiàn)明顯改變,但高劑量組雌鼠體重增長(zhǎng)受到明顯限制,說(shuō)明高劑量組有中毒反應(yīng)。

    2.1.3 孕鼠和胎鼠 各試驗(yàn)組孕鼠在妊娠期間一般健康狀況良好,高劑量組孕鼠體重增加和子宮連胎重兩項(xiàng)指標(biāo)與CK組比較有差別,其它指標(biāo)與CK組比較均無(wú)差別,見(jiàn)表1。

    2.2 圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn) 見(jiàn)表2。

    2.2.1 對(duì)仔鼠體重的影響 高劑量組新生仔鼠體重與CK組相比減少,有顯著性差異(P<0.05),但出生后第21天各組仔鼠體重與CK組相比較無(wú)明顯差別。

    2.2.2 對(duì)其它體征的影響 各劑量組仔鼠開(kāi)耳、長(zhǎng)牙、睜眼時(shí)間與CK組相比均無(wú)明顯差別(P>0.05),反映神經(jīng)功能的指標(biāo)(翻正反向,陰性趨地試驗(yàn),斷崖回避試驗(yàn)和游泳能力)各劑量組仔鼠與CK相比也無(wú)明顯差別。

    2.2.3 對(duì)F1子代生殖功能的影響 與CK相比,各劑量組F1子代小鼠交配能力,受孕率,總著床數(shù),活胎數(shù),死胎數(shù),吸收胎數(shù),子宮連胎重和總畸形率無(wú)明顯差別(P>0.05)。

    3 討 論

    發(fā)育中的胚胎對(duì)外界毒物非常敏感,往往在對(duì)成體不產(chǎn)生毒性的劑量下,對(duì)胚胎就可產(chǎn)生毒性,從而引起發(fā)育停滯和出生缺陷[5]。有關(guān)妊娠期受毒性藥品影響胚胎發(fā)育,造成著床數(shù)減少、死胎和吸收胎數(shù)增加或影響出生子代生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的報(bào)道很多[6]。孕前或孕期遭受毒物會(huì)延緩胚胎的正常發(fā)育,導(dǎo)致發(fā)育停滯或死亡,出現(xiàn)吸收胎,活胎體重減輕,胎仔脊柱裂、腭裂、性腺發(fā)育不良等畸形;本文結(jié)果表明,在高劑量組條件下胚胎體重明顯低于陰性對(duì)照組,而在5 mg/kg劑量組與CK相比沒(méi)有明顯差異,故在10 mg/kg體重劑量下有可能對(duì)胚胎造成影響,但由于沒(méi)有劑量效應(yīng)關(guān)系,所以不能肯定在10 mg/kg劑量下就產(chǎn)生胚胎毒性,在現(xiàn)有條件下,該實(shí)驗(yàn)可以證明,在5 mg/kg劑量時(shí)未對(duì)雄鼠或孕鼠產(chǎn)生毒性,提示此劑量下FX應(yīng)用于臨床可能是安全的。

    出生前暴露于外源性毒素能引起雄性子代生殖系統(tǒng)發(fā)育異常,如隱睪,睪丸、附睪重量減輕,精子數(shù)目減少,這是檢測(cè)外源性毒素樣物質(zhì)作用的指標(biāo)[7]。本文結(jié)果表明,F(xiàn)X對(duì)雄鼠睪丸無(wú)毒性反應(yīng)劑量大約為5 mg/kg體重,用10 mg/kg劑量處理時(shí)對(duì)雄鼠的體重和睪丸系數(shù)都有一定的影響,但病理檢查未見(jiàn)退變及壞死等病理反應(yīng),可認(rèn)為睪丸系數(shù)的相對(duì)增加主要是由于體重減少,造成睪丸質(zhì)量相對(duì)增加所致。精子量、精子活動(dòng)度、交配頻度和雄鼠的生育率未見(jiàn)明顯差異。故僅憑本文結(jié)果不能斷定高劑量組具有生殖毒性,但在5 mg/kg體重劑量藥物應(yīng)該是安全的,還有待于臨床的進(jìn)一步研究。

    [1]吳保平,高春芳,張亞歷,等.東亞鉗蝎毒生物提取物對(duì)人大腸癌細(xì)胞的體外抑殺實(shí)驗(yàn).中國(guó)肛腸病雜志,.1993,4(1):3-6.

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    表1 FX激肽原酶對(duì)雌性小鼠F0生殖功能的影響

    表2 蛇毒激肽原酶對(duì)F1仔鼠一般體征的影響(±s)

    表2 蛇毒激肽原酶對(duì)F1仔鼠一般體征的影響(±s)

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