反芻動物瘤胃微生物氨同化作用研究進展

王芃芃 譚支良

（1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室,長沙 410125; 2.中國科學院研究生院,北京 100049）

反芻動物雖可以消化粗飼料,但其中的含氮物質(zhì)的利用率較低,攝入蛋白質(zhì)僅有不到20%能夠被轉化為畜產(chǎn)品[1]。而當飼喂高蛋白質(zhì)飼糧時,動物機體的消化能力較強,瘤胃微生物合成效率較弱,兩者之間的不平衡又成為限制反芻動物提高飼糧氮素轉化效率的主要因素[2]。因此,瘤胃內(nèi)微生物的蛋白質(zhì)合成機理及其利用效率一直是反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)研究領域的熱點。

反芻動物飼料中的蛋白質(zhì),40%～80%被瘤胃微生物降解成氨。且對于大多數(shù)瘤胃微生物而言,氨是其生長所必需的首選氮源。有研究認為瘤胃細菌和原蟲蛋白質(zhì)中的氮有70%和50%分別來源于氨[3]。瘤胃微生物利用氨合成微生物蛋白質(zhì)（m icrobial protein,MCP）,其生物合成效率與瘤胃內(nèi)氨的濃度和總量密切相關,且進入反芻動物后腸道的MCP通常占非氨氮總量的34%～89%[4]。然而,盡管瘤胃內(nèi)氨濃度變化受到多種因素影響,但氨的產(chǎn)量始終遠大于瘤胃微生物利用氨合成自身蛋白質(zhì)的總量。而過量的氨則以被動擴散或主動吸收的方式被機體吸收,并主要通過肝臟轉化成尿素流失到體外[5]。氮素的大量流失不僅造成排泄物對環(huán)境的污染,而且造成十分寶貴的蛋白質(zhì)資源利用效率較低。目前的研究主要是通過優(yōu)化飼糧結構來提高反芻動物飼糧氮轉化率。然而,瘤胃內(nèi)各類微生物利用氮源的機理并不十分明晰,僅通過飼糧調(diào)控途徑提高瘤胃MCP合成效率是相當有限的。為此,充分了解瘤胃微生物利用氮素尤其是氨合成MCP的反應過程,并探討瘤胃微生物同化氨的分子機制,將從本質(zhì)上為調(diào)控并提高反芻動物氮利用率提供關鍵科學依據(jù)。

1 反芻動物瘤胃微生物氨同化作用進程

瘤胃微生物種類繁多、數(shù)量龐大,主要包括細菌、真菌、原蟲和噬菌體等。幾類微生物間相互作用,形成了一個精密的微生態(tài)系統(tǒng),對飼料營養(yǎng)物質(zhì)進行著復雜的消化、吸收和代謝。其中,瘤胃原蟲不能直接利用瘤胃氨合成氨基酸,是瘤胃氨的凈生產(chǎn)者,而瘤胃細菌和真菌則可直接利用瘤胃氨合成MCP,滿足其自身生長需求。

1.1 瘤胃微生物氨同化作用概述

瘤胃微生物對于瘤胃氨的利用主要是通過氨化和轉氨作用完成。大量試驗表明,瘤胃微生物內(nèi)普遍存在的2條主要氨同化反應路徑:1）谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase,GDH）路徑,即α-酮戊二酸和氨在GDH參與下生成谷氨酸;2）谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶復合酶系（glutam ine synthetase-glutamate synthase,GS-GOGAT）路徑,即谷氨酸和氨在GS作用下生成谷氨酰胺,而谷氨酰胺和α-酮戊二酸又可在GOGAT的作用下生成谷氨酸（圖1）。2條路徑的終產(chǎn)物均是谷氨酸,其在瘤胃游離氨基酸池中的以氨氮從頭合成的氨基酸中含量是最高的。

圖1 瘤胃微生物GDH和GS-GOGAT代謝路徑Fig.1 The GDH and GS-GOGAT metabo lic pathw ays of rumen m icroorganisms

除上述2條主要路徑外,瘤胃微生物氨同化作用還存在著其他路徑。Burchall等[6]在以瘤胃非纖維分解菌Streptococcus bovis為研究對象的純培養(yǎng)試驗中,并未檢測到GS的存在,而是提純得到了天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase,AS）。之后, Blake等[7]應用同位素15N標記氨技術,提出AS路徑可能是瘤胃細菌同化氨的另一條重要路徑。且在高氨濃度下,丙氨酸作為該路徑下的終產(chǎn)物,常以瘤胃游離氨基酸池中的優(yōu)勢氨基酸被檢測到[8]。

此外,于革蘭氏陰性纖維分解菌——產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌中發(fā)現(xiàn)的丙氨酸脫氫酶（alanine dehydrogenase,ADH）路徑是除GDH路徑外瘤胃細菌同化氨的另一條重要路徑。而且在該菌中也未能檢測到GS,且認為其功能由AS代替[9]。

其中,GDH和ADH系統(tǒng)被認為是瘤胃微生物氨同化作用過程中與氨低親和性的系統(tǒng),而GSGOGAT系統(tǒng)則被認為是與氨高親和性的系統(tǒng)。換而言之,一般情況下,低氨濃度時,GS-GOGAT系統(tǒng)發(fā)揮主要功效;高氨濃度時,GDH和ADH的功能占主導地位。

1.2 瘤胃細菌氨同化作用

據(jù)統(tǒng)計,每毫升瘤胃內(nèi)容物中含有細菌1010～1011個,這使得瘤胃細菌在瘤胃微生物中占據(jù)數(shù)量優(yōu)勢。目前已分離鑒定的瘤胃細菌有200多種,在瘤胃發(fā)酵過程中的各個方面發(fā)揮著重要作用[10]。

記憶中，在我4歲那年，由中國國際電視總公司出品了一部41集古裝神話劇——改編自明代小說家吳承恩同名文學古典名著《西游記》。1986年春節(jié)一經(jīng)播出便轟動全國，可謂老少皆宜，獲得了極高評價。至今仍是寒暑假期間被重播最多的電視劇之一，百看不厭，成為一部公認的、無法超越的經(jīng)典。該劇講述的是孫悟空、豬八戒、沙僧輔保大唐高僧玄奘(唐僧)去西天取經(jīng)的故事，師徒四人一路搶灘涉險，降妖伏怪，歷經(jīng)九九八十一難，取回真經(jīng)，終修成正果的故事。

瘤胃細菌可根據(jù)凈碳水化合物-蛋白質(zhì)體系（CNCPS）分為發(fā)酵結構性碳水化合物的細菌和發(fā)酵非結構性碳水化合物的細菌。普遍認為,前者僅能利用氨作為其生長所需氮源,后者則可利用氨、氨基酸和肽共同作為其生長所需氮源[11]。

1.2.1 發(fā)酵結構性碳水化合物的瘤胃細菌氨同化作用

結構性碳水化合物主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。瘤胃纖維分解菌對氨氮的利用主要是通過GDH路徑和ADH路徑完成。氨同化作用過程中,關鍵酶的活性受氨濃度影響較大,但因菌種的不同存在著一定的差異。

Duncan等[12]通過批次培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)試驗得到Ruminococcus flavefaciensFD-1氨同化作用過程中的主要參與酶是GDH和GS,在氨氮受限制的培養(yǎng)基中酶活性較高。M orrison等[13]以R.flavefaciens和蛋白質(zhì)分解菌Prevotella rum inicola為研究對象驗證了GDH路徑是這2種瘤胃細菌同化氨的主要路徑。但在P.rum inicola中,GDH活性受肽濃度調(diào)節(jié),與氨濃度無關。

M atheron等[9]以核磁共振技術研究Fibrobacter succinogenesS85碳氮代謝關系時提出,參與氨同化作用的2個主要作用酶是GDH和ADH。于細胞抽提物中并未檢測到GS。谷氨酰胺經(jīng)由AS路徑合成。NAD-GDH和NADP-GDH均存在反應活性,且其表達量不受低氨濃度的限制。丙酮酸和氨在NADPH-ADH的作用下合成丙氨酸,然而并未檢測到其逆反應的發(fā)生。此外,應用分光光度計和核磁共振技術檢測到谷氨酸-丙酮酸轉氨酶（glutamate-pyruvate transam inase,GPT）和谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶（g lutam ate-oxaloacetate transam inase,GOT）的活性很高。

纖維分解菌不能在沒有氨的培養(yǎng)基中存活,但是氨基酸的加入可以刺激其生長、提高其纖維降解率,而肽的加入使得純纖維分解菌在以纖維二糖為底物的培養(yǎng)基上生長更為迅速[14]。A tasoglu等[15]以瘤胃3種纖維分解菌Rumincoccus albusSY 3、R.flavefaciens17和F.succinogenesBL2為研究對象得出,氨氮在細胞氮中的比例隨其他氮源濃度的增加而減少。當培養(yǎng)基中肽濃度為1 g/L時,平均80%的細胞氮來源于氨氮。當培養(yǎng)基中其他氮源濃度較高時,如胰蛋白酶達到10 g/L或者氨基酸濃度達到15.5 g/L時,3種纖維分解菌的細胞氮中非氨氮的氮所占比例分別為46%、43%和51%。且纖維二糖比纖維素做底物更有利于氨氮的利用。

1.2.2 發(fā)酵非結構性碳水化合物的瘤胃細菌氨同化作用

非結構性碳水化合物可分為水溶性碳水化合物（包括單糖、雙糖、低聚糖和一些多糖）和不溶于水的大分子多糖。非纖維分解菌對氨氮的利用主要是通過GDH路徑和GS路徑完成,可以從頭合成多種自身所需氨基酸,且大多數(shù)不存在GOGAT路徑。

Patterson等[16]以Succinivibrio dextrinosolvensC18和C24 2個菌株為試驗對象,同時進行連續(xù)培養(yǎng)。在限制氨氮濃度的培養(yǎng)基中,GS和尿酶活性較高,而GDH活性較低,表明此種狀況下GS路徑是氨同化作用過程中的主要路徑;而在高氨濃度培養(yǎng)基中,GS活性銳減,尿酶、GDH和丙酮酸激酶活性不變。相似的,瘤胃非纖維分解菌Selenomonas ruminantium在低氨濃度培養(yǎng)基中,氨同化作用關鍵酶亦是GS,GDH活性雖然較低但并未被抑制[17]。然而在Ruminobacter amylophilus中,GS高表達的同時GDH活性卻被抑制[18],且2種菌均為檢測到GOGAT活性。高氨濃度培養(yǎng)基中,S.bovis的GDH活性亦顯著高于GS活性[19]。

在氨濃度范圍為0.045～0.436 g N/L的培養(yǎng)基中分別對3種瘤胃非纖維分解菌Prevotella bryantiiB1 4、S.ruminantiumHD4和S.bovisES1進行純培養(yǎng)試驗。隨著培養(yǎng)基中氨濃度的遞增,P.bryantii和S.ruminantium2種菌中氨氮在細胞氮和氨基酸氮中所占比例逐漸增加,而在S.bovis中,除氨濃度極低情況下,氨氮在微生物蛋白氮中所占比例基本保持不變。3種非纖維分解菌利用氨氮從頭合成的氨基酸量最大的是谷氨酸和天冬氨酸,之后是絲氨酸和賴氨酸（P.bryantii）、絲氨酸和蘇氨酸（S.ruminantium）、絲氨酸和丙氨酸（S.bovis）。脯氨酸合成量最低,之后是苯丙氨酸（P.bryantii）、賴氨酸（S.ruminantium）、脯氨酸和苯丙氨酸以及異亮氨酸（S.bovis）。此現(xiàn)象與S.bovis為淀粉分解菌以及不同氮源的選擇性轉運和氨同化作用過程中的不同作用酶的活性存在差異有

關[20]。

1.3 瘤胃厭氧真菌氨同化作用概述

瘤胃厭氧真菌是反芻動物瘤胃纖維分解微生物類群中的重要組成成員。較纖維分解菌而言,瘤胃厭氧真菌缺乏蛋白質(zhì)降解能力。在缺乏氨基酸的培養(yǎng)基中,可以以氨為唯一氮源合成自身所需氨基酸滿足生長需求[21]。但外源氨基酸可以刺激其生長,其中賴氨酸是限制其生長的主要氨基酸[20]。GDH路徑和GS-GOGAT路徑是瘤胃真菌同化氨的2條主要反應路徑。

2 反芻動物瘤胃微生物氨同化作用的關鍵酶

瘤胃微生物利用氨合成MCP是在許多酶的參與下完成的。Erfle等[22]利用瘤胃混合菌進行連續(xù)培養(yǎng)試驗得出,GS-GOGAT在正常瘤胃氨濃度情況下活性很低,但當氨濃度極低時該系統(tǒng)的酶活性很高。ADH的米氏常數(shù)（Km）為70mmol/L,在氨濃度極高的情況下該酶發(fā)揮著固定氨的作用。而AS和天冬氨酸轉氨酶（aspartate am inotransferase）的活性不受瘤胃內(nèi)氨濃度的影響。

2.1 GDH

瘤胃微生物中提取得到的GDH分為NADGDH和NADP-GDH。前者用于降解谷氨酸,后者用于谷氨酸的合成[23]。據(jù)報道,NAD-GDH多存在于R.albus和Pep tostrep tococcus elsdenii中; NADP-GDH多存在于S.bovis、R.flavefaciens、Bacteroides succinogenes、Bacteroides amylophilus、S.ruminantium和Butyrivibrio fibriso lvens中。部分瘤胃細菌體內(nèi)既含有NADH-GDH又含有NADPH-GDH,兩者常常在量上相當,但后者的酶活性往往更高。

Duncan等[24]純化鑒定了R.flavefaciensFD-1中的GDH。該酶和它的亞基大小分別為280和48 ku,為六聚體。此酶為NADP（H）依賴型,達到其最佳活性時需要0.5 mol/L KC l,最適pH為6.9～7.0。以N端序列為寡聚核苷酸探針可用于克隆和分離GDH基因。

Erfle等[22]在對瘤胃混合菌進行連續(xù)培養(yǎng)試驗時觀測到:人工瘤胃發(fā)酵初接種時,NAD-GDH和NADP-GDH活性均降低,2種蛋白量相當;連續(xù)培養(yǎng)4 d后酶活性恢復,在氨同化作用中占據(jù)主導地位。天冬氨酸和谷氨酸濃度不隨氨濃度變化。氨濃度較低時,瘤胃微生物傾向于合成丙氨酸和甘氨酸。當氨濃度較高時,丙氨酸濃度上升的很快,說明丙氨酸可能是氨的一個儲存載體,也可能是為了轉化為葡萄糖前體。

2.2 GS

GS是許多含氮化合物合成過程中重要的第一步反應關鍵酶。瘤胃氨和谷氨酸在GS的作用下生成谷氨酰胺,需要ATP水解提供的能量和陽離子團的參與[25]。GS在氨同化作用過程中發(fā)揮著極其重要的作用,是潛在的藥物靶點。

系統(tǒng)發(fā)育研究證明編碼GS的基因是現(xiàn)存的最古老的功能性基因之一。GS蛋白家族可分為3個類型:GSⅠ、GSⅡ和GSⅢ。Ⅰ型主要分布于細菌;Ⅱ型主要分布于與植物共生的細菌以及真核細胞中;Ⅲ型首先發(fā)現(xiàn)于專性厭氧類桿菌中,后在一些厭氧細菌和藍細菌中發(fā)現(xiàn)。研究R.albus8假定基因glnN側翼序列得出,該基因下游121核苷處有一個融合于基因glnK中的編碼胺轉運酶（am tB）的開放閱讀窗[26]。

GS活性既受到氨濃度調(diào)節(jié)又受其他因素影響。高氨濃度下,GS活性往往銳減。但是用緩沖液沖洗培養(yǎng)基中的細胞,或者在培養(yǎng)基中添加蛇毒磷酸二酯酶均可使GS活性恢復。S.dextrinosolvens在限制氨濃度培養(yǎng)基中,錳離子的加入可以抑制其GS活性,而在高氨濃度（15 mmo l/L）培養(yǎng)基中培養(yǎng)過后錳的加入將刺激GS活性[16]。Masclaux-Daubresse等[27]以煙草為研究對象時指出,蛋氨酸亞砜酰亞胺可以極大地抑制GS活性,而不影響GDH的氨化和脫氨基作用。

2.3 GOGAT

GOGAT最初發(fā)現(xiàn)于非瘤胃細菌中,可將1分子谷氨酸與1分子α-酮戊二酸反應生成2分子谷氨酸,該過程將NADPH轉化成NADP。Erfle等[22]利用瘤胃混合菌進行連續(xù)培養(yǎng)試驗中,檢測到了該酶的存在。

3 反芻動物瘤胃微生物氨同化作用調(diào)控

反芻動物瘤胃微生物以飼糧蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的氨、肽和氨基酸為氮源,以飼糧有機物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸和ATP分別為碳架和能量合成MCP的過程,受到諸多因素調(diào)控。如飼糧碳源組成、不同氮源、瘤胃微生物的細胞膜通透性和氨同化作用酶的活性。

瘤胃內(nèi)的氨濃度可以從飼喂低氮飼糧時的1mmol/L到飼喂高氮飼糧時的瞬時濃度40mmol/L,變化幅度很大[28]。然而每種瘤胃微生物對氨氮的利用量卻變化不大。Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)氨轉運蛋白（AM Ts）廣泛存在于古細菌、細菌、真菌、植物和動物中,是氨的重要轉運載體。古細菌和細菌中的AMTs,能特異性地轉運NH4+和協(xié)同轉運NH3/H+,即借助AM Ts細菌能夠逆濃度梯度轉運NH3[30]。

H ungate[31]率先提出飼糧碳水化合物的組成和濃度影響瘤胃微生物對氨及飼糧氮源的利用。與以大豆蛋白質(zhì)為氮源的綿羊相比,飼喂尿素的綿羊瘤胃細菌抽提物中,尿酶、谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶和谷氨酸-丙氨酸轉氨酶以及GDH的活性均較低,說明飼糧氮源類型影響瘤胃微生物種群及其生存環(huán)境,進而影響到瘤胃氮素代謝[32]。

肽和氨基酸同樣影響氨同化作用。純培養(yǎng)非纖維分解菌P.bryantiiBa4、S.rum inantiumHD4、S.bovisES1的研究顯示,氨基酸和肽的加入使得氨同化作用合成的氨基酸種類和數(shù)量發(fā)生變化。其中,較其他氨基酸（甚至是丙氨酸）而言,谷氨酸和天冬氨酸總是大量從頭合成[33]。而且,非纖維分解菌細胞氮和氨基酸氮中來源于氨氮的量隨培養(yǎng)基中肽和氨基酸濃度的增加而減少[34]。

4 小 結

瘤胃細菌利用氨合成自身所需氨基酸是一個復雜精密的反應過程,此過程受到多種因素影響,使得瘤胃混合菌或者單個菌種在不同條件下利用氨的能力存在一定差異。瘤胃細菌對瘤胃內(nèi)環(huán)境及自身狀況的“感知”、細菌細胞膜從外環(huán)境中對優(yōu)勢氮源的篩選以及合成自身蛋白質(zhì)的過程中關鍵酶的交替均受到嚴格的調(diào)控,有待進一步的研究。只有從根本上明確反應機制,才能大幅度改善反芻動物的蛋白質(zhì)營養(yǎng)轉化率。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:zltan@isa.ac.cn

（編輯 田艷明）