農(nóng)藥和化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

李貞，李丕鵬，徐齊艷，陸宇燕，*

1.沈陽師范大學(xué)中國兩棲爬行動物保護(hù)與繁育研究中心遼寧省生物進(jìn)化與生物多樣性重點實驗室，沈陽110034

2.遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110042

農(nóng)藥和化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

李貞1，李丕鵬1，徐齊艷2，陸宇燕1，*

1.沈陽師范大學(xué)中國兩棲爬行動物保護(hù)與繁育研究中心遼寧省生物進(jìn)化與生物多樣性重點實驗室，沈陽110034

2.遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110042

以兩棲動物研究環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)進(jìn)而監(jiān)測環(huán)境的變化，已成為國內(nèi)外的研究熱點.兩棲類的胚胎發(fā)育和變態(tài)過程對水的依賴性極強(qiáng)，而且鰓和皮膚有很強(qiáng)的滲透性，當(dāng)其受到污染脅迫時，在細(xì)胞、組織及生理生化水平上都會發(fā)生顯著變化，進(jìn)而會影響其存活和生長發(fā)育.在總結(jié)國內(nèi)外相關(guān)研究基礎(chǔ)上，綜述和分析了農(nóng)藥、化肥（氮肥）對無尾兩棲類蝌蚪的行為表現(xiàn)、生長發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)和生理生化變化等方面的毒性效應(yīng)，以期為農(nóng)藥、化肥的水環(huán)境監(jiān)測及合理使用提供全面的科學(xué)依據(jù).

蝌蚪；化肥；農(nóng)藥；環(huán)境監(jiān)測

近20年來，世界范圍內(nèi)兩棲動物種群數(shù)目急劇減少及畸形蛙大量出現(xiàn)的現(xiàn)象提示水環(huán)境污染已成為威脅其生存的主要因素之一（Blaustein et al.,1994;Wake,1991;牛海崗等，2009）.水生毒理學(xué)的研究，以往主要集中在魚類和水生無脊椎動物，近年來的研究指出：無尾兩棲類的幼體——蝌蚪，由于其在變態(tài)前有外鰓暴露于水環(huán)境、其皮膚缺少保護(hù)結(jié)構(gòu)致使具有較高的滲透性，水環(huán)境中的污染物能較快地在其體內(nèi)大量富集，因此被廣泛用作指示生物進(jìn)行水體有害物質(zhì)及水質(zhì)的監(jiān)測，并取得了較好的效果（周景明等，2006;Stansley et al.,1992;Mann et al.,2009）.

近年來，隨著農(nóng)產(chǎn)品需求量的不斷增加，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中各種農(nóng)藥和化肥的施用量也在不斷增加.由于產(chǎn)品劑型、施用方法及超量使用等原因，農(nóng)藥、化肥在增產(chǎn)的同時也對環(huán)境帶來了嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng).利用無尾兩棲類蝌蚪研究農(nóng)藥、化肥的毒性效應(yīng)進(jìn)而監(jiān)測其對環(huán)境的影響，已成為近年來國內(nèi)外研究的熱點（Hyaes et al.,2003;Ortiz-Santaliestra and Sparling,2007;De Wijer et al.,2003;呂秀芬，1989;南旭陽等，2000;苑宇哲等，2005;丁道韌等，1992;苗德志和李松梧，2007）.

本文以無尾兩棲類蝌蚪的活動行為、胚胎發(fā)育及生長發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)和生理生化變化等作為生物學(xué)指標(biāo)，對農(nóng)藥、化肥對其的毒性效應(yīng)進(jìn)行了綜述，以期為農(nóng)藥、化肥的水環(huán)境監(jiān)測及合理使用提供全面的科學(xué)依據(jù).

1 農(nóng)藥污染及其對蝌蚪的毒性效應(yīng)

1.1 農(nóng)藥污染源

目前我國農(nóng)藥使用中存在的突出問題是使用不合理（王雪芳，2004），嚴(yán)重破壞了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，主要表現(xiàn)在：1）大多數(shù)農(nóng)藥直接噴灑于農(nóng)作物表面，其中僅有10%左右藥劑被吸收，而大部分農(nóng)藥則隨大氣流動或雨水流失.大氣中的農(nóng)藥分子與人體皮膚和眼睛粘膜等接觸，或通過呼吸道吸入可引起疾病，嚴(yán)重的會導(dǎo)致急性中毒、慢性中毒，甚至致癌；有些持續(xù)性有機(jī)污染物甚至已污染到了兩極地區(qū).2）農(nóng)藥噴施時，部分農(nóng)藥粗顆粒、粉粒落入土壤中,大氣中的農(nóng)藥顆粒也會沉降進(jìn)入土壤中，這些農(nóng)藥在土壤中的分解緩慢，而數(shù)量又在不斷增加，導(dǎo)致土壤物理化學(xué)性質(zhì)的改變，進(jìn)而直接影響作物的生長；3）土壤中農(nóng)藥殘留量及衍生物含量增加，對土壤中有益的動物及微生物具有明顯的危害，降低了土壤的生物活性，破壞了土壤的生態(tài)環(huán)境；4）土壤中的農(nóng)藥被灌溉水、雨水沖刷到江河湖海中，污染水源，造成水生生物的大量死亡，同時也使?jié)O業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)遭受到經(jīng)濟(jì)損失（邱小燕，2008）.

1.2 農(nóng)藥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應(yīng)

由于農(nóng)藥的有效成分均具有一定毒副作用，在無尾兩棲類的棲息地水域受農(nóng)藥污染后，必將導(dǎo)致在卵孵化及后期的發(fā)育和變態(tài)中出現(xiàn)不同程度的損傷，故表現(xiàn)出較高的死亡率和某些生理缺陷的發(fā)生.

1.2.1 對蝌蚪的活動行為和存活率的影響

在對有機(jī)磷農(nóng)藥（二嗪磷）染毒的卞氏皺蛙（Ptychadena bibroni）蝌蚪的觀察中發(fā)現(xiàn)，隨著農(nóng)藥濃度的升高，蝌蚪表現(xiàn)出逐漸強(qiáng)烈的回避反應(yīng)，即呈現(xiàn)不正常的游泳姿態(tài)，軀體作劇烈的扭動；隨著染毒時間的延長，蝌蚪對觸動的反應(yīng)逐漸遲鈍.暴露于梯度濃度的二嗪磷溶液中兩周的蝌蚪，死亡率隨著濃度的升高而升高，在25μg·L-1中蝌蚪的死亡率高達(dá)75%（Ezemonye and Ilechie,2007）；而與有機(jī)磷農(nóng)藥有相近作用的有機(jī)氯農(nóng)藥（DDT）對蝌蚪染毒情況的報道中，也指出其可以引起蝌蚪“多動癥”（Sparling et al.,2001）.對于這兩種農(nóng)藥的作用機(jī)理，目前認(rèn)為：農(nóng)藥通過與蝌蚪乙酰膽堿酯酶的酯解部位結(jié)合，致使該酶失活，從而使乙酸膽堿積聚，引起膽堿能神經(jīng)先興奮后抑制的一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（黃伯俊，1993;Berrill et al.,1998;Broomhall,2005），神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂直接導(dǎo)致蝌蚪運(yùn)動異常的發(fā)生，以及蝌蚪最后的死亡.

1.2.2 對胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育的影響

在無尾兩棲類個體發(fā)育過程中，農(nóng)藥對其有顯著影響.首先，農(nóng)藥對蝌蚪有致死效應(yīng)，但是致死率會受發(fā)育期的影響.通常孵化期、開口期對農(nóng)藥刺激的敏感性較強(qiáng)，而孵化期之前、開口期之前及開口期之后的敏感程度均小于這兩個特殊時期，而在上述三者之間，孵化期的死亡率最低（盧祥云等，2002）.此種情況與不同發(fā)育時期的特點有關(guān)，孵化期胚胎脫離了卵膠膜的保護(hù)作用，致使農(nóng)藥成分可直接滲透進(jìn)入正在發(fā)育中的胚胎，故死亡率明顯提升；而到開口期后，蝌蚪開始了主動吞咽動作，農(nóng)藥溶液隨水流進(jìn)入蝌蚪消化道，又一次導(dǎo)致了死亡率的攀升.而經(jīng)過了孵化期與開口期的“選擇”存活下來的蝌蚪，可通過自身的應(yīng)激修復(fù)表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性（Pilar Honrubia et al.,1993），這種能力存在著明顯的個體差異.其次，農(nóng)藥對蝌蚪具有顯著的致畸效應(yīng).如部分農(nóng)藥可引起蝌蚪代謝受阻導(dǎo)致其體內(nèi)的滲透壓改變，引起胚體水腫，表現(xiàn)在：蝌蚪尾部和軀體出現(xiàn)明顯扭曲，腹部膨大呈透明狀，四肢發(fā)育不健全（Bridges,2000）；由于蝌蚪體壁結(jié)構(gòu)簡單，而其神經(jīng)系統(tǒng)及脊索（柱）又位于體背部的表層，故極易受到農(nóng)藥成分的浸蝕，進(jìn)而引起神經(jīng)系統(tǒng)及脊索（柱）發(fā)育的異常，導(dǎo)致蝌蚪出現(xiàn)扭曲（Bridges,2000;楊曉梅等，2001）.最后，農(nóng)藥對蝌蚪的體重、體長也有顯著影響.如黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）蝌蚪在較高濃度的除草劑稻草隆溶液里，反應(yīng)敏感，攝食活動相對頻繁，在蝌蚪的體重、體長的數(shù)值上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過對照組（劉木養(yǎng)等，2006）；而斑腿泛樹蛙（Polypedates leucomystax）蝌蚪在較高濃度的農(nóng)藥溶液中卻表現(xiàn)出明顯的生長抑制現(xiàn)象（姚丹，2005;呂秀芬，1989），這種毒性效應(yīng)的差異可能是由農(nóng)藥種類及其毒性機(jī)制不同以及物種差異所致.

1.2.3 對組織結(jié)構(gòu)的影響

鰓是蝌蚪與外界進(jìn)行氣體交換的器官，由于鰓絲及其內(nèi)毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)相當(dāng)簡單，故其對水環(huán)境中毒物具有極強(qiáng)的敏感性.農(nóng)藥可導(dǎo)致蝌蚪鰓結(jié)構(gòu)損傷.如在對伊比利亞綠蛙（Rana perezi）蝌蚪的觀察中，發(fā)現(xiàn)氨基甲酸酯類殺蟲劑（ZZ-Aphox）染毒第1天的蝌蚪鰓上皮細(xì)胞部分萎縮退化呈不連續(xù)狀態(tài)，但由于刺激了蝌蚪自身的應(yīng)激機(jī)制，使上皮細(xì)胞粘液分泌增多，故經(jīng)一段時間后結(jié)構(gòu)呈恢復(fù)趨勢（Pilar Honrubia et al.,1993）.

肝臟是蝌蚪重要的解毒器官，在農(nóng)藥作用下，蝌蚪肝臟結(jié)構(gòu)與功能受損.主要表現(xiàn)在：肝臟外觀顏色變淺、肝細(xì)胞排列緊密、肝血竇增大、可見局部區(qū)域出現(xiàn)壞死現(xiàn)象、脂滴及糖原堆積、線粒體數(shù)量減少等（Pilar Honrubia et al.,1993）.農(nóng)藥在蝌蚪體內(nèi)代謝過程及蝌蚪的應(yīng)激過程中均會產(chǎn)生較多的活性氧自由基，其可引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)（主要的膜性結(jié)構(gòu)）的損傷，同時也可激活肝臟內(nèi)有關(guān)抗氧化酶及一些代謝酶的活性，引起肝細(xì)胞代謝的異常（Pilar Honrubia et al.,1993;姚丹，2005;劉陽，2006）.

農(nóng)藥同樣可影響蝌蚪另一個與解毒排毒有關(guān)的器官——腎臟.如在經(jīng)敵敵畏染毒暴露10天后，斑腿泛樹蛙（Polypedates leucomystax）蝌蚪腎臟明顯萎縮，體積顯著縮?。╬＜0.01）（姚丹，2005），蝌蚪腎臟受損進(jìn)而造成代謝廢物排泄障礙，死亡率上升.

除此之外，水環(huán)境中的農(nóng)藥可通過蝌蚪皮膚的滲透，作用于分化中的生殖原基，導(dǎo)致蝌蚪性腺發(fā)育缺陷，嚴(yán)重影響兩棲類個體的正常繁殖功能，同時也導(dǎo)致畸形個體的增長，這是導(dǎo)致兩棲動物物種衰退的重要原因（Daughton and Tenres,1999;Hayes et al.,2003;Reeder et al.,1998;Sower et al.,2000）.

1.2.4 對抗氧化系統(tǒng)的影響

生物體在長期進(jìn)化過程中，形成了一套完整的抗氧化系統(tǒng)，用于清除體內(nèi)多余的活性氧.抗氧化酶作為抗氧化系統(tǒng)的重要組成，在診斷環(huán)境污染問題中發(fā)揮著重要的生物指示作用.動物體內(nèi)的抗氧化酶主要包括：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽過氧化物（GSH-PX）和谷胱甘肽（GSH）等.當(dāng)生物體遭受氧化脅迫時，其抗氧化酶就會被誘導(dǎo)或抑制（劉碩和周啟星，2008）.

以不同濃度的阿特拉津、敵百蟲、敵敵畏等溶液對無尾兩棲類蝌蚪進(jìn)行染毒，其抗氧化系統(tǒng)變化均表現(xiàn)出相似規(guī)律：在較低濃度時抗氧化酶（SOD和CAT）作用不明顯，或具有一定的誘導(dǎo)作用，而在高濃度時卻表現(xiàn)出極顯著的抑制作用（謝文平和馬廣智，2003;楊麗華等，2003;苑宇哲等，2004;侯亞妮，2007;耿保榮等，2006）.這種雙向作用的機(jī)理可能是當(dāng)蝌蚪機(jī)體中活性氧產(chǎn)生初期，誘導(dǎo)了機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化酶活性升高；而當(dāng)氧自由基大量產(chǎn)生并累積后，會導(dǎo)致抗氧化酶系的酶變性，從而降低了其活性，也有可能是通過使SOD合成酶失活或是酶的轉(zhuǎn)錄或翻譯途徑受阻所致，具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討.

1.2.5 對遺傳物質(zhì)的影響

農(nóng)藥對無尾兩棲類蝌蚪的遺傳毒性已被大量實驗證實.由于蝌蚪的紅細(xì)胞較大且易于觀察，因此蝌蚪紅細(xì)胞微核被廣泛用于水環(huán)境中農(nóng)藥遺傳毒性的檢測，并獲得了較好的效果（Békaert et al.,1999;Hooftman and De Raat,1982;Grinfeld et al.,1986;Jaylet et al.,1986;湯新慧，1999;南旭陽，2000;周雪瑞等，2005;苑宇哲等，2005）.研究表明：農(nóng)藥會誘導(dǎo)蝌蚪紅細(xì)胞微核及核異常產(chǎn)生，使微核率及核異常率顯著升高（封少龍等，2004）.Feng等（2004）采用微核試驗及彗星試驗研究了兩種新型殺蟲劑（Imidaeloprid和RH-5849）對黑斑蛙（Rana nigronaculata）蝌蚪及成體血細(xì)胞的遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Imidaeloprid和RH-5849的濃度分別為8mg·L-1和40mg·L-1時，蝌蚪血細(xì)胞微核率比對照組有顯著提高；而濃度分別為0.05mg·L-1和5mg·L-1時，對黑斑蛙成體紅細(xì)胞DNA就有極顯著的損傷作用，且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.鐘碧瑾等（2009）采用微核試驗和單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)三唑磷暴露下沼水蛙（Hylarana guentheri）蝌蚪微核率和核異常率顯著升高.蝌蚪細(xì)胞微核率的高低與農(nóng)藥劑量、處理時間、細(xì)胞有絲分裂的速度等因素有關(guān)（王蕊芳等，1996;苑宇哲等，2005;樓允東和吳萍，1996;孟順龍等，1996）.

2 化肥污染及其對蝌蚪的毒性效應(yīng)

2.1 化肥污染源

化肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最基礎(chǔ)且最重要的物質(zhì)投入，主要包括單元素化肥如氮肥、磷肥、鉀肥和由兩種至三種元素混合組成的復(fù)合肥.據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，化肥在對農(nóng)作物增產(chǎn)的總份額中約占40%～60%.盡管化肥在農(nóng)業(yè)發(fā)展中有著不可替代的作用，但由于其使用量逐年增加，使土壤無機(jī)化現(xiàn)象愈加嚴(yán)重.據(jù)報導(dǎo)農(nóng)作物對氮肥的綜合利用率僅為20%～30%，其余部分則滲透到淺層地下水，或隨雨水、灌溉用水流入地表水體中溶解形成N，不斷的累積導(dǎo)致水體氮素含量過高，引起水體的富營養(yǎng)化.而N在生物體內(nèi)被還原成N，其可將血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而使血紅蛋白的載氧能力下降，誘發(fā)高鐵血紅蛋白血癥，嚴(yán)重時使生物窒息死亡；同時水體的富營養(yǎng)促進(jìn)了藻類的大量繁殖，致使水中的溶氧量降低，引起水質(zhì)惡化進(jìn)而也會威脅到其他水生生物的正常生存（苗德志和李松梧，2007）.近年來兩棲類動物數(shù)量的大量衰退可能也與此原因有關(guān)（Watt and Jarvis,1997;Rouse et al.,1999）.各種化肥中，氮肥用量最大，且對水體的污染最為嚴(yán)重，因此目前有關(guān)化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應(yīng)研究主要以氮肥為主.

2.2 氮肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應(yīng)

2.2.1 對活動行為的影響

硝酸鹽類化肥對蝌蚪的毒性效應(yīng)首先表現(xiàn)在行為異常方面（Baker and Waights,1993）.歐洲蟾蜍（Bufo bufo）蝌蚪接觸硝酸銨化肥溶液初期表現(xiàn)出無方向性的劇烈游動，且身體扭曲，但放回清水活動異常的現(xiàn)象逐漸減輕甚至消失；染毒6天后，蝌蚪出現(xiàn)勾尾、打圈游動；隨著濃度升高或時間延長，出現(xiàn)攝食率降低、游動無力且不平衡、碰觸反應(yīng)遲鈍、體表黏液增多，最后蝌蚪活力明顯降低直至癱瘓而死.本實驗室對磷酸二銨染毒花背蟾蜍（Bufo raddei.）的觀察也證明了這一點，同時發(fā)現(xiàn)剛開始染毒的蝌蚪還有明顯的排便量增加的現(xiàn)象.造成這些現(xiàn)象的原因可能是多方面的，蝌蚪在主動吞咽作用時氮肥溶液進(jìn)入其消化道，影響了腸道中的有益共生菌群，導(dǎo)致其消化功能異常，而表現(xiàn)出攝食頻率的降低（Hecnar,1995）；此外，氮肥可能通過滲透作用造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，進(jìn)而引起了蝌蚪運(yùn)動方式的異常，并改變了蝌蚪對環(huán)境的敏感性（Xu and Oldham,1997）；而蝌蚪體內(nèi)的NO2-引起的血紅蛋白攜氧能力快速降低，最終影響蝌蚪的各種生理功能，導(dǎo)致其死亡（Train,1979）.

2.2.2 對存活率的影響

氮肥對蝌蚪的致死效應(yīng)較為復(fù)雜.首先，不同物種蝌蚪對化肥的敏感程度不同（Geiffis-Kyle and Ritchie,2007;Hecnar,1995;XuandOldham,1997）.其次，不同化肥對同種蝌蚪的致死濃度也存在明顯差異，如碳酸氫銨對黑斑蛙（Rana nigronaculata）的致死濃度幾乎是尿素的48倍（丁道韌等，1992）.最后，氮肥的致死效應(yīng)受蝌蚪發(fā)育期的顯著影響，如用同濃度的硝酸銨化肥溶液處理鋤足蟾（Pelobates cultripes）蝌蚪4天，新孵化的個體幾乎全部死亡，而發(fā)育期較晚的蝌蚪死亡率則不到40%（Ortiz-Santaliestra et al.,2006），此現(xiàn)象說明蝌蚪不同發(fā)育期可能對化肥的敏感程度存在顯著差異.現(xiàn)有實驗結(jié)果均提示由于蝌蚪在不同發(fā)育時期具有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能，導(dǎo)致其對外界環(huán)境因素刺激的反應(yīng)不同，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對化肥的使用，應(yīng)結(jié)合蝌蚪的發(fā)育時間合理安排，調(diào)整使用濃度、使用時間或種類，從而在保證農(nóng)作物對肥料需求基礎(chǔ)上，盡可能地避開在蝌蚪發(fā)育的“脆弱”階段使用對蝌蚪傷害大、或者超出蝌蚪最大耐受濃度的使用量.

2.2.3 對生長發(fā)育和免疫系統(tǒng)的影響

氮肥可引起蝌蚪發(fā)育畸形（Marco and Blaustein,1999）.以硝酸鹽類化肥為例，當(dāng)濃度在100mg·L-1時即可導(dǎo)致歐洲蟾蜍（Bufo bufo）蝌蚪17%的畸形率，并呈現(xiàn)出隨濃度升高，畸形率升高的趨勢（Xu and Oldham,1997）.畸形的類型有：蝌蚪頭、胸部發(fā)育不對稱、眼睛畸形、腹部水腫透明、尾部有水腫的瘤泡出現(xiàn)及勾尾等現(xiàn)象（Hecnar,1995）.蝌蚪正常情況下，可以維持自身的滲透壓，但在化肥溶液中浸浴后，由于化肥的離子作用，破壞了蝌蚪正常的調(diào)節(jié)功能，失去了維護(hù)體內(nèi)正常滲透壓能力.而由于化肥對蝌蚪的損傷作用是一個由表及里的過程，因此，隨著染毒時間的延長，化肥對蝌蚪的作用勢必會深入至蝌蚪生理功能的調(diào)節(jié)方面，既影響到各種分泌腺的功能，甚至殃及蝌蚪的免疫調(diào)節(jié)方面.

以化肥的降解副產(chǎn)物——高氯酸鹽處理南方豹蛙（Rana sphenocephala）蝌蚪，用硝酸鉀化肥浸染美洲林蛙（Rana sylvatica）蝌蚪均發(fā)現(xiàn)其變態(tài)發(fā)育時間延長，甚至有很大比例不能完成變態(tài)發(fā)育過程而死亡（Ortiz-Santaliestra and Sparling,2007;Greulich and Pflugmacher,2003;Geiffis-Kyle,2005）.組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)蝌蚪的甲狀腺腺泡體積明顯縮小，進(jìn)而表現(xiàn)出對甲狀腺激素分泌的抑制（Ortiz-SantaliestraandSparling,2007;Greulichand Pflugmacher,2003;Geiffis-Kyle,2005）.有實驗指出硝酸鹽化肥染毒3周后，蝌蚪體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量和血紅蛋白的含量均明顯降低，即蝌蚪的免疫系統(tǒng)在化肥的作用下，也表現(xiàn)出了一定程度的損傷（Rouse et al.,1999;Dappen,1983）.

2.2.4 對組織結(jié)構(gòu)及遺傳物質(zhì)的影響

有關(guān)化肥對蝌蚪組織結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)的影響尚鮮有報道.本實驗室初步觀察發(fā)現(xiàn)，氮肥磷酸二銨可對花背蟾蜍（Bufo raddei.）肝臟組織造成明顯的損傷，其顯微及超微結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)在：肝細(xì)胞呈明顯的脂肪變性，出現(xiàn)由于淋巴細(xì)胞浸潤形成的斑塊狀壞死區(qū)域，核內(nèi)異染色質(zhì)濃縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)，且血竇內(nèi)的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和枯否細(xì)胞逐漸增多；肝細(xì)胞糖原含量隨磷酸二銨作用時間延長而降低，隨化肥濃度升高而增多；蛋白含量和乳酸脫氫酶活性隨染毒濃度升高和時間延長有增加的趨勢；肝細(xì)胞內(nèi)不同類型的抗氧化酶活性雖然變化有所不同，但酶活性變化均有明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng).此外，還發(fā)現(xiàn)磷酸二銨對蝌蚪也具有遺傳毒性，可誘導(dǎo)蝌蚪紅細(xì)胞微核及核異常的產(chǎn)生，并且紅細(xì)胞微核率、核異常率與濃度、染毒時間呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性；從實驗結(jié)果看，低于大田施肥量的磷酸二銨，已經(jīng)構(gòu)成了對蝌蚪組織結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)的毒性效應(yīng)（王銳等，2009）.

3 結(jié)語

近幾十年來，全球范圍內(nèi)的兩棲類動物出現(xiàn)了較快的種群數(shù)量下降，其中一些物種已經(jīng)滅絕.由于兩棲類個體發(fā)育的特殊性，其對生境的島嶼化、水質(zhì)的污染、疾病、人為過度捕捉等多種因素表現(xiàn)出高度的敏感性（于鳳蘭和陸宇燕，2006）.農(nóng)藥與化肥的不合理使用所引起的水體污染是造成這一現(xiàn)象的重要原因.

農(nóng)藥可對無尾兩棲類蝌蚪的影響目前研究較為深入，其對蝌蚪活動行為、胚后發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)、抗氧化系統(tǒng)、遺傳物質(zhì)等造成的損傷已有充分的實驗依據(jù)，但是還有一些問題值得進(jìn)一步探討：1）蝌蚪通過體內(nèi)哪些途徑對農(nóng)藥的毒性產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性，從而在低毒農(nóng)藥染毒下死亡率維持在較低水平？2）關(guān)于農(nóng)藥對蝌蚪組織器官的損傷研究較少，其中各器官組織產(chǎn)生功能損害的機(jī)制是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)？3）農(nóng)藥的神經(jīng)毒性是否只與抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)？對于神經(jīng)沖動的傳入和傳出過程是否也會有影響？4）農(nóng)藥對蝌蚪生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響有哪些具體途徑參與，目前國內(nèi)外缺乏此部分研究.5）農(nóng)藥對蝌蚪內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的毒性研究相對不足.

與農(nóng)藥相比，國內(nèi)外關(guān)于化肥對無尾兩棲類蝌蚪影響的研究相對較少，對化肥對蝌蚪的毒性研究主要集中在存活率、孵化率及畸形率變化等宏觀方面，對微觀方面的研究相對貧乏.建議進(jìn)一步的研究可從如下幾方面進(jìn)行：1）從分子（基因、蛋白）、細(xì)胞、器官和整體水平上，綜合探討化肥對蝌蚪產(chǎn)生損害的機(jī)制與規(guī)律.2）化肥污染是否會引起蝌蚪個體生殖系統(tǒng)的損傷，進(jìn)而影響其正常的繁殖，最終導(dǎo)致種群的衰減，還有待于證實.3）確定蝌蚪體內(nèi)對化肥污染較敏感的生物指標(biāo)，將會為化肥污染的監(jiān)測提供極大的幫助.4）關(guān)于化肥對蝌蚪遺傳物質(zhì)的影響尚需進(jìn)一步研究.

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Research Advances in Toxicological Effects of Pesticide and Fertilizer Pollutants on the Anuran Larvae

LI Zhen1，LI Pi-peng1，XU Qi-yan2，LU Yu-yan1，*

1.Center for China Herp-Breeding and Conservation Research,Key Laboratory of Evolution and Biodiversity in Liaoning,Shenyang Normal University,Shenyang 110034
2.Liaoning Cancer Hospital&Institute,Shenyang 110042

The amphibian is considered as a suitable animal model to determine the toxicity of polluted environmental and to monitor the environmental health.The embryonic development and metamorphosis of amphibians are highly dependent on the water,and the gill and skin are highly permeable.When exposed to pollutants,amphibians can be changed obviously on the level of the molecule expression,cellular and tissue structure,and physiology.The pollutants may affect the survival and growth of amphibians.In this paper,it was summarized and reviewed that the toxic effect of pesticides and fertilizers on the behavior,growth and development,structural,physiological and biochemical changes of amphibian larvae,in order to provide a comprehensive scientific basis for monitoring the environment of water and logical rational use of agricultural compounds.

tadpole；fertilizer；pesticides；environmental monitoring

12 October 2009accepted1 December 2009

1673-5897（2010）2-287-08

X171.5

A

2009-10-12錄用日期：2009-12-01

國家自然科學(xué)基金項目（No.30470206；No.30870276）；遼寧省優(yōu)秀人才支持計劃和省高校科研計劃項目

李貞（1984—），女，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:luyuyan2001@yahoo.com

陸宇燕（1962─），女，教授，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)；兩棲爬行動物生物學(xué)及其保護(hù)與繁育.