口腔與胃內(nèi)幽門(mén)螺桿菌基因型關(guān)系的研究*1

高 靜 張 麗 侯 云 肖長(zhǎng)杰 高德安

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院口腔科 ，山東 泰安 271000)

幽門(mén)螺桿菌 (helicobacter pylori，Hp)的傳播途徑至今尚未完全明了，但多數(shù)研究[1-2]的結(jié)果顯示，在自然環(huán)境中人是唯一的傳染源，人—人之間傳播是唯一的傳播途徑，人—人之間的傳播是通過(guò)口—口和胃—口傳播，其根據(jù)是貯存在胃粘膜上的Hp隨胃上皮細(xì)胞的脫落可存活在胃液中，通過(guò)胃—食道返流進(jìn)入口腔，進(jìn)而滯留在牙菌斑中，并通過(guò)唾液傳播感染。此外口腔Hp在根除胃內(nèi)Hp感染后仍然存在[3]，有可能是胃感染復(fù)發(fā)或再感染的主要原因。本研究目的在于分析胃病患者胃幽門(mén)螺桿菌與口腔幽門(mén)螺桿菌的基因型，以及同一家庭成員口腔幽門(mén)螺桿菌的基因型，以明確胃與口腔的Hp是否具有同源性，為證實(shí)口—口和胃—口傳播途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 選擇胃Hp陽(yáng)性并伴菌斑Hp陽(yáng)性患者(6人)的胃粘膜、菌斑樣本共10份(胃粘膜4份，菌斑6份)。6例患者的胃鏡和病理診斷分別為慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍。6人中有1人是胃Hp陽(yáng)性患者家屬，以進(jìn)行該家屬攜帶的Hp與患者Hp的基因同源性分析。

1.2 標(biāo)本取樣 所有患者的菌斑和唾液標(biāo)本均在胃鏡檢查和活檢前采集。菌斑取樣：從每例患者口腔內(nèi)選擇有牙齦炎癥的6顆牙作為取樣牙。以棉球隔濕，吹干后分別用消毒刮匙刮取齦上、齦下菌斑。將取樣標(biāo)本置于含100 μl樣本處理液的Eppendorf管內(nèi)。胃粘膜取樣：胃鏡檢查時(shí)從患者的胃竇部取3塊活檢組織，液氮速凍保存。

1.3 DNA提取及PCR檢測(cè)Hp

1.3.1 提取DNA 標(biāo)本懸浮于100 μl樣本處理液中，56 ℃孵育30 min,高速震蕩10 s后置100 ℃水浴8 min，再次高速震蕩10 s，離心(12000 r/min,4 ℃)3 min。取上清用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 PCR檢測(cè)Hp 參考Bickley,Lage等的研究，引物根據(jù)尿素酶C基因和CagA基因進(jìn)行設(shè)計(jì)。尿素酶C基因：引物1(UC1)5’-GCCAATAAATTAGTT-3’，引物2(UC2)5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’，擴(kuò)增片段為294 bp；CagA基因：引物1為5’-AATACACCAACGCCTAG-3’，引物2為5’-TTATTGCCGCTTTTGCTCTC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段為400 bp。20 μl反應(yīng)體系內(nèi)含有兩對(duì)引物各20 pmol/L，每種寡核苷酸4 mmol/人，DNA模板4 μl ,Tag DNA 聚合酶2U及PCR緩沖液，反應(yīng)在 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)上進(jìn)行，94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸2 min為一個(gè)循環(huán)，共計(jì)35循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃繼續(xù)延伸7 min，以Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637(中國(guó)預(yù)防科學(xué)院提供)的DNA提取液作陽(yáng)性對(duì)照，采用PCR試劑盒內(nèi)的陰性對(duì)照，用8%丙烯酰胺電泳鑒定PCR產(chǎn)物。每一位受檢者12份牙菌斑中只要有1份Hp陽(yáng)性，則該受檢者口腔Hp檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)為陽(yáng)性。

1.4 胃粘膜PCR產(chǎn)物(尿素酶C基因)的直接測(cè)序 需測(cè)序的胃粘膜DNA標(biāo)本的PCR擴(kuò)增方法同1.3，重復(fù)擴(kuò)增3～4管，然后合并擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，加入溶液體積1/10的3M乙酸鈉(pH5.2)及溶液體積3倍的無(wú)水乙醇，混勻后在-20℃冰箱中放置1 h以上，12000 r/min離心15 min，小心吸盡液體，加入20 μl TE緩沖液，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。在365 nm紫外燈下切下含DNA的凝脈。凝脈塊中DNA的提取方法用二氧化硅微粒法提取，放在洗滌和干燥后的玻璃瓶中加入10 μl三蒸水。吸出的DNA溶液保存在-20 ℃，然后送寶生物技術(shù)公司用尿素酶C的正向引物作DNA測(cè)序。

1.5 菌斑尿素酶C PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序 菌斑標(biāo)本的尿素酶C PCR產(chǎn)物量較少，標(biāo)本量有限，所以用刀片從銀染后干燥的聚丙烯酰胺凝膠中切下陽(yáng)性條帶，放在1.5 ml Eppendorf管中，加入TE緩沖液30 μl，放置30 min，搗碎，再反復(fù)凍融及震蕩3次，離心后吸取上清液2 μl作為PCR的DNA模板。然后按上述的方法提取測(cè)序用的DNA模板。

2 結(jié) 果

將同一患者不同部位或同一患者治療前后胃粘膜或口腔PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以及患者及家屬的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(尿素酶C基因)進(jìn)行測(cè)序，并配對(duì)比較。結(jié)果用Clustal W 分析軟件(http://www.ebil.ac.uk)分析。

2.1 患者1胃粘膜和牙菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序的比較 患者1的最初病理診斷為胃潰瘍。胃粘膜和牙菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示有兩處堿基不同，一處胃粘膜Hp菌株的堿基T與其它菌株的測(cè)序結(jié)果不同，而菌斑的堿基則為T(mén)/C；另一處顯示胃粘膜Hp的堿基與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同，為T(mén)，而菌斑則為T(mén)/C。說(shuō)明口腔中存在兩種菌株的混合感染，一種可能與胃粘膜菌株相同，另一種則不同于胃粘膜菌株。該患者服藥4周后再次復(fù)查胃Hp的感染狀況，結(jié)果13C呼氣試驗(yàn)為陽(yáng)性。

2.2 患者2胃粘膜和牙菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序比較 患者2胃粘膜和菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示兩處堿基不同。該患者服藥4周后復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)為Hp陰性，1年后復(fù)查結(jié)果轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。

專注不等于固步自封，一直以來(lái)，國(guó)威將前瞻適用的技術(shù)應(yīng)用于裁切設(shè)備的研發(fā)，早在2009年就推出了67小型切紙機(jī)，填補(bǔ)了當(dāng)時(shí)國(guó)內(nèi)數(shù)碼切紙機(jī)的空白。在林孝國(guó)的詮釋中，數(shù)碼切紙機(jī)就是“傻瓜機(jī)”，客戶不需要掌握特別的技藝就能進(jìn)行操控。而對(duì)于最近出現(xiàn)頻率頗多的“智能化”，國(guó)威也早有考慮，今年6月，公司將名稱從原來(lái)的“浙江國(guó)威印刷機(jī)械有限公司”更改為現(xiàn)在的“浙江國(guó)威智能設(shè)備有限公司”或正是其布局之一。在明年召開(kāi)的PRINT CHINA 2019上，我們或?qū)⒖吹絿?guó)威推出的智能化的無(wú)人操作的設(shè)備。

2.3 患者3胃粘膜和菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序的比較 患者3胃粘膜和菌斑PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果完全一致，此患者胃粘膜和口腔菌斑的兩處堿基對(duì)完全一致。說(shuō)明該患者胃粘膜和菌斑Hp菌株的基因型是相同的。該患者服藥4周后復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)為Hp陰性，1年后復(fù)查結(jié)果轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。

2.4 患者4胃粘膜與藥物治療后牙菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序比較 患者4胃粘膜與藥物治療4周后牙菌斑的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示共三處堿基不同。藥物治療前此患者口腔未能檢測(cè)到Hp，藥物治療4周后菌斑檢測(cè)出Hp。該患者服藥4周后復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)為Hp陽(yáng)性，1年后復(fù)查結(jié)果仍為陽(yáng)性。

2.5 患者與其家屬牙菌斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的測(cè)序比較 測(cè)序結(jié)果顯示兩標(biāo)本有兩處堿基不同。該患者服藥4周后復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)為Hp陽(yáng)性，1年后復(fù)查結(jié)果仍為陽(yáng)性。

3 討 論

幽門(mén)螺桿菌是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病因子，并且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。Hp在人群中的感染率較高，全球多數(shù)地區(qū)Hp感染率在60%左右。我們前面的研究[6]結(jié)果顯示，口腔是Hp在人體內(nèi)的另一貯存地，同一患者胃內(nèi)Hp與口腔Hp究竟是否為同一菌株，其基因型是否相同尚無(wú)定論。本研究旨在從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步檢測(cè)胃Hp與口腔Hp的基因同源性，論證胃與口腔Hp的關(guān)系。

近年來(lái)，國(guó)外一些研究用PCR檢測(cè)胃和口腔中的Hp。Oshowo[7]用PCR技術(shù)結(jié)合限制性內(nèi)切酶比較分析了15名患者胃粘膜和菌斑中的Hp，發(fā)現(xiàn)其中13名患者兩部位的菌株具有相同的酶切圖譜，而其中4例菌斑、胃粘膜、十二指腸三處菌株的酶切圖譜相同。Song等[8]從8位胃Hp陽(yáng)性患者和12位胃Hp陰性患者的牙菌斑、含漱液和胃粘膜標(biāo)本提取DNA后，用EHC-U/EHCH-L和ET5-U/ET5-L為引物進(jìn)行N-PCR擴(kuò)增，其口腔標(biāo)本的個(gè)人檢出率為100%。本研究對(duì)胃與口腔陽(yáng)性標(biāo)本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測(cè)序，結(jié)果顯示同一患者牙齒菌斑中的Hp與胃粘膜Hp有97%以上的同源性，表明口腔與胃Hp菌株的基因型基本相同或略有不同。本研究對(duì)4名患者口腔與胃Hp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測(cè)序，結(jié)果顯示患者齦下菌斑與其本人的胃粘膜PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果相同或有1～3個(gè)堿基不同，說(shuō)明胃與口腔Hp的基因同源性達(dá)到98%以上，口腔Hp與胃粘膜Hp可能來(lái)自同一菌株，或同一菌株發(fā)生個(gè)別變異。

有關(guān)Hp基因型變異的機(jī)制目前尚未明確，可能是Hp在人體長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。不同的Hp菌株在其感染個(gè)體和他們的后代繼續(xù)繁殖生存，在長(zhǎng)期慢性的感染過(guò)程中，通過(guò)基因組的重組、突變、轉(zhuǎn)化以及基因序列的改變而出現(xiàn)新的變異菌或亞群，以更好地適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境，長(zhǎng)期生存下去。另一方面Hp微小的基因型變異可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)突變的累積，或是不同菌株間的等位基因的轉(zhuǎn)移所致。以往有關(guān)胃內(nèi)不同部位或同一部位Hp的DNA分析顯示，胃內(nèi)不同部位或同一部位存在同一菌株的感染，但多數(shù)表現(xiàn)出個(gè)別堿基的差異，與本研究胃與口腔Hp的測(cè)序結(jié)果相類似。我們的研究證實(shí)口腔存在與胃內(nèi)基因型相同的菌株，表明口腔與胃內(nèi)可能為同一菌株的感染。而口腔Hp的基因型與胃Hp的基因型的微小差異則反映了菌株和宿主間的相互作用。

一些研究資料顯示，胃癌高發(fā)區(qū)的國(guó)家和人群的幽門(mén)螺桿菌感染率也高，幽門(mén)螺桿菌感染率與胃癌死亡率呈明顯的正相關(guān)。幽門(mén)螺桿菌不具備基因毒性，不會(huì)直接引起人體細(xì)胞DNA突變及細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，但幽門(mén)螺桿菌所分泌的大量氨和磷脂酶等可以破壞胃粘膜的保護(hù)機(jī)制，使各種具有致癌作用的因子直接作用于粘膜上皮細(xì)胞，同時(shí)幽門(mén)螺桿菌分泌的化學(xué)物質(zhì)也可以直接促進(jìn)細(xì)胞分裂，增加DNA突變的機(jī)會(huì)。

目前為止，大多數(shù)的研究認(rèn)為Hp感染的傳播途徑可能為口—口傳播。Song等[8]提取一位母親含漱液和其孩子的菌斑標(biāo)本DNA后，比較PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物(230 bp)的測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者的DNA序列完全相同，表明Hp可能通過(guò)口—口途徑傳播給兒童，這種傳播途徑與鏈球菌的傳播途徑相似。我們的研究結(jié)果顯示，Hp感染患者與共同生活的家屬的菌斑PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅有3個(gè)堿基的差異，可能是來(lái)自同一菌株的變異菌或亞群，家屬口腔中的Hp可能為胃Hp感染復(fù)發(fā)或再感染的隱患因素。且患者家屬并沒(méi)有胃Hp感染表現(xiàn)，而患者本人服藥4周后復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)為Hp陽(yáng)性，1年后復(fù)查結(jié)果仍為陽(yáng)性，推測(cè)口腔Hp可能是胃內(nèi)Hp感染的貯存地，患者及其家屬之間密切接觸和共同的生活習(xí)慣可能互相感染Hp，使患者具有胃Hp再感染或感染復(fù)發(fā)的可能性，為口—口傳播假設(shè)提供依據(jù)。

本研究對(duì)胃粘膜與口腔Hp的測(cè)序結(jié)果比較進(jìn)一步說(shuō)明同一個(gè)體口腔Hp與胃內(nèi)Hp可能來(lái)源于同一菌株，口腔Hp是胃內(nèi)Hp感染的重要病原因素。同一家庭成員的口腔Hp測(cè)序結(jié)果尚未見(jiàn)報(bào)告。本研究例數(shù)較少，但結(jié)果顯示患者口腔菌斑與其本人的胃粘膜PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果為基本型相同或有1～3個(gè)堿基不同，基因同源性達(dá)到98%以上，說(shuō)明口腔Hp與胃粘膜Hp基因型相同或基本相同，不同部位的Hp可能來(lái)自同一菌株，或同一菌株發(fā)生個(gè)別變異。

口腔是Hp的重要聚集地，口腔Hp可能是胃復(fù)發(fā)或再感染的潛在因素。口腔Hp與胃內(nèi)Hp可能為同源菌株，但口腔內(nèi)的Hp如何定植于胃內(nèi)以及Hp的再感染或復(fù)發(fā)的菌株是否與其本人口腔中的Hp為同一菌株等尚需進(jìn)一步研究?？傊狙芯靠梢詾榻窈笪概c口腔Hp關(guān)系的研究提供一定的理論依據(jù)。

[1] Olsson K，Wadstrǜm T, Tuszkiewicz T. helicobacter pylori in dental plaques[J]. Lancet,1993,341:956 - 957.

[2] Li C，Musich PR, Ha T, et al. High prevalence of Helicobacter pylori in saliva demonstrated by a novel PCR assay[J]. J Clin Pathol,1995,48 :662 - 666.

[3] 胡文杰,曹采方,孟煥新,等. 胃病患者口腔中的幽門(mén)螺桿菌[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,13 (4):261 - 263.

[4] Warren JR, Marshall BI. Vnidentified cunved bacillion gastric epitheliumin active chronic gastritis[J]. Lancet, 1983, 1:1273-1275.

[5] David A. The report of the Digestive Health Internaional update conferenie on Helicobacter pylori[J]. Gastroenterology, 1997, 113: S4-S8.

[6] 胡文杰，曹采方，孟煥新,等.牙周炎及胃病患者牙菌斑中的幽門(mén)螺桿菌[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,34(1)：49-51

[7] Oshowo A, Gillam D, Botha A, et al. Helicobacter pylori : The Mouth , Stomach , and Gut Axis[J]. Annal of Periodontology, 1998,3(1):276 - 280.

[8] Song QS, Spahr A, Schmid RM, et al. Helicobacter pylori in the oral cavity : Hih prevalence and grear DNA diversity[J]. Degestive Diseases and Science, 2000,45 (11) : 2160 - 2167.