飼料中霉菌毒素的微生物脫毒研究進展

趙必遷，周安國

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，教育部抗病營養(yǎng)研究中心，四川 雅安 625014；2.攀枝花市行遠牧業(yè)有限公司，四川 攀枝花 617061）

霉菌毒素是一類差異巨大的小分子量化合物，由微生物經(jīng)過次生代謝過程產(chǎn)生，對飼料的污染十分常見。據(jù)估計，目前已有約100 000種霉菌被鑒定，其中約400種對動物具有潛在的毒性，這些具有潛在毒性的霉菌中約5%可以產(chǎn)生有毒物質(zhì)。年均氣溫較高的國家和地區(qū)這一問題尤其嚴重，而中國正處于亞熱帶地區(qū)，各地區(qū)的種植水平差異很大，飼料原料貯運條件參差不齊，因此由霉菌毒素導(dǎo)致的動物急性、慢性中毒較為常見。

1 霉菌毒素的危害

霉菌是一種多細胞微生物，可通過種子或孢子兩種形式繁衍后代，條件不適宜時往往由孢子形式繁衍。霉菌毒素由中溫霉菌產(chǎn)生，相對細菌而言，霉菌對濕度、pH的要求較低。當霉菌處于干燥、低溫或處于與其他霉菌競爭的應(yīng)激情況時，會產(chǎn)生霉菌毒素。由于霉菌生長有一定的地域性，導(dǎo)致不同區(qū)域占優(yōu)勢的霉菌毒素種類不同。飼料中常見的產(chǎn)毒素霉菌主要有曲霉屬（aspergillus）、青霉屬（penicillium）、鐮孢菌屬（fusatium）和麥角菌屬（claviceps）等。各種霉菌可以產(chǎn)生多達數(shù)百種霉菌毒素，常見的霉菌毒素有：黃曲霉毒素（aflatoxins）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A）、單端孢霉烯族毒素（trichothecenes）、玉米赤霉烯酮（zearalenone）、伏馬菌素（fumonisins）等[1]。

霉菌毒素可以對動物引起一系列嚴重的生理和生物毒害，如致癌性（黃曲霉毒素、褚曲霉毒素和伏馬霉素）、致突變性（黃曲霉毒素和柄曲霉毒素）、致畸胎性（褚曲霉毒素）、致雌激素異常（玉米赤霉烯酮）、致出血（單端孢霉烯）、免疫毒性（黃曲霉毒素和褚曲霉毒素）、腎毒性（褚曲霉毒素）、肝毒性（黃曲霉毒素）、皮膚毒性（單端孢霉烯）及神經(jīng)毒性（麥角堿）等，另外還有些具有細胞毒性[2]。

2 霉菌毒素的微生物脫毒

微生物脫毒法是利用一些特定的微生物或其產(chǎn)生的酶來降解霉變飼料中的霉菌毒素，將這些微生物加入飼料中，實現(xiàn)霉菌毒素的溫和降解，避免高溫、強酸、強堿等易破壞營養(yǎng)成分的環(huán)境和條件，達到去除霉菌毒素的目的，此過程中，無需帶入有毒有害的化學物質(zhì)，同時還盡可能地減少了飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失[3]。

2.1 酵母發(fā)酵去除霉菌毒素

酵母發(fā)酵過程去除谷物中的霉菌毒素的方法研究較早并得到了一定的效果。一些微生物（包括酵母、霉菌及細菌）可將玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)化為α-玉米赤霉烯醇及β-玉米赤霉烯醇，但這種轉(zhuǎn)化尚不能被認為是一種脫毒過程，因為兩者都具有生殖毒性。棒曲霉毒素可被數(shù)種酵母菌降解，Moss等對釀酒酵母分解棒曲霉毒素的終產(chǎn)物進行了研究，結(jié)果表明棒曲霉毒素已喪失[4]。F2毒素污染的糧食可作為假絲酵母發(fā)酵的底物，發(fā)酵后毒素幾乎全部留在發(fā)酵液中，其活性降低了10倍[5]。Janos等將 3種不同酵母菌株放在1個容器中同時添加赭曲毒素A、煙曲霉毒素B1和B2進行發(fā)酵8 d后，赭曲毒素A、煙曲霉毒素B1和B2分別減少了13%和28%、17%[6]。

2.2 非產(chǎn)毒霉菌發(fā)酵去除霉菌毒素

Park等在研究一種韓國發(fā)酵豆制品時發(fā)現(xiàn)，這種豆制品的天然發(fā)酵過程中有約20種不同的霉菌參與，其中米曲霉、青霉、毛霉和根霉是其中的優(yōu)勢真菌，在發(fā)酵的前3~4周（塊狀發(fā)酵階段），發(fā)酵制品中的黃曲霉毒素B1及G1明顯增加；在其后進行的鹽水浸泡發(fā)酵階段，黃曲霉毒素則被迅速降解。鹽水浸泡發(fā)酵階段2個月后，黃曲霉毒素的量已經(jīng)降至最初毒素量的10%～20%，而第 3個月時黃曲霉毒素幾乎被完全降解，研究表明，在天然發(fā)酵食品的制備過程中，存在著有效的降解霉菌毒素的微生物或生化過程[7]。Varga等共對70株曲霉進行了研究，發(fā)現(xiàn)有一株A.japonicus和兩株A.niger可以降解或部分降解赭曲霉毒素A，在對 A.niger CBS120.49株的研究中發(fā)現(xiàn)，其在液體培養(yǎng)基中分解OA較慢，OA可以在7 d內(nèi)全部轉(zhuǎn)化為毒性較低的化合物赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素A的量在發(fā)酵前6 d逐漸增加，但在隨后的10 d培養(yǎng)中被進一步降解至痕量。而在固體培養(yǎng)基中，OA的降解速度要快得多，OA含量可在2 d內(nèi)降解到初含量的20%以下，而5 d內(nèi)OA就可全部轉(zhuǎn)化為赭曲霉毒素α。Varga等對根霉屬（Rhizopus）不同種的55個菌株進行了研究，發(fā)現(xiàn)有不少根霉菌株可分解赫曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和棒曲霉毒素[8]。其中可以降解赭曲霉毒素的 R.stolonifer,R.microsporus,R.homothallicus,R.oryzae以及4株未鑒定到種的根霉株系，其中有一根霉株系可以在16 d內(nèi)將赭曲霉毒素A降解95%以上；一株R.stolonifer則可有效地降解潮濕小麥中的赭曲霉毒素A[9]。

2.3 細菌降解霉菌毒素

據(jù)報道，綿羊、牛等反芻動物瘤胃內(nèi)容物的細菌能分解某些真菌毒素。為了獲得能降解赭曲毒素A的微生物，F(xiàn)uchs等對37種細菌、10株酵母和12種霉菌進行了篩選，發(fā)現(xiàn)醋酸鈣不動桿菌在25和30℃條件下，均能將初始質(zhì)量濃度為10 ng·L－1的赭曲毒素A分解，其終產(chǎn)物比赭曲毒素A對雞胚的毒性低了很多。腸道中的微生物菌群可以通過酶促降解環(huán)氧環(huán)從而對嘔吐毒素（DON）起減毒作用，F(xiàn)uchs等從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到1株可以在24～48 h內(nèi)轉(zhuǎn)化 DON和其他單端孢霉烯族毒素的厭氧優(yōu)桿菌屬細菌，從而部分地減輕毒素的毒力[10]。Volkl等發(fā)現(xiàn)一種可以把 DON轉(zhuǎn)變成3-酮基-DON的混合微生物培養(yǎng)物餅[11]。

Line等對黃桿菌屬的Flavobacterium aurantiacum降解黃曲霉毒素B1的機理進行了研究，結(jié)果表明，有活性的黃桿菌細胞可以快速地將黃曲霉毒素B1（可溶于氯仿）轉(zhuǎn)化為水溶性的化合物。試驗6 h后，活細胞試驗組結(jié)果只有24.1%的放射性保留在氯仿層中；而無細胞的空白試驗組則不會產(chǎn)生任何水溶性化合物（即放射性全部保留在氯仿層中）；滅活的黃桿菌細胞對照組則有99.7%的放射性保留在氯仿層中，且不產(chǎn)生水溶性的化合物。這一結(jié)果表明，活的和死的黃桿菌細胞均可去除毒素[12]。

Nagendra等研究了4株雙歧桿菌和2株乳桿菌吸附黃曲霉毒素B1的能力，將乳酸菌與黃曲霉毒素 B1在37℃混合振動15、60和120min后，檢測其中的黃曲霉毒素 B1，結(jié)果表明，乳酸菌對黃曲霉毒素B1去除能力為20%～50%，用蒸餾水洗滌兩遍吸附黃曲霉毒素B1的乳酸菌后，有10%～40%的黃曲霉毒素B1還被吸附在乳酸菌上，說明乳酸菌對黃曲霉毒素B1有較強的吸附作用[13]。E1-Nezami等篩選出了兩株鼠李糖乳桿菌ATCC53103和鼠李糖乳桿菌DSM-705，兩株菌吸附黃曲霉毒素B1的能力高達80%；吸附著黃曲霉毒素B1的乳酸菌細胞經(jīng)乙醇、紫外線照射、超聲或堿處理后死菌對黃曲霉毒素B1的吸附強度不受影響[14]。李志剛等研究結(jié)果證實，乳酸菌-黃曲霉素復(fù)合體無論是在益生菌活菌狀態(tài)，還是死菌狀態(tài)，與自由黃曲霉毒素的回復(fù)突變無顯著差異，故益生素吸附黃曲霉素能力取決于細胞壁結(jié)構(gòu)，且革蘭氏陽性菌吸附能力優(yōu)于革蘭氏陰性菌[15]。

3 微生物去除霉菌毒素機理

3.1 微生物對霉菌毒素的吸附作用

有研究表明，酵母對霉菌毒素的影響可能與酵母細胞壁表面的葡甘聚糖有關(guān)。酵母或酵母細胞壁成分可作為霉菌毒素吸附劑使用。酵母細胞壁對毒素的吸附能力明顯強于酵母的全成分，這說明酵母細胞壁的特殊結(jié)構(gòu)對霉菌毒素產(chǎn)生吸附力。酵母細胞壁分3層，外層為甘露寡糖和蛋白復(fù)合物，中間層為葡聚糖，內(nèi)層為幾丁質(zhì)，細胞壁上有多糖、蛋白質(zhì)和脂類，這些物質(zhì)對毒素的吸附是通過氫鍵、離子鍵和疏水作用力等實現(xiàn)的。酵母細胞壁提取物是以釀酒酵母為原料，經(jīng)過細胞破壁、酶解、分離提純和干燥等工藝精制而成。蘇軍等研究將鐮刀菌毒素自然污染的玉米以 25%和50%的比例等量替換基礎(chǔ)飼糧中的正常玉米，并在此基礎(chǔ)上加或不加葡甘露聚糖（EGM）霉菌毒素吸附劑觀察其對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、養(yǎng)分利用率的影響。結(jié)果表明，飼喂被鐮刀菌毒素污染的飼糧降低了仔豬的生產(chǎn)性能，且隨霉變玉米替代比例增加，采食量和日增重降低程度增加，顯著或極顯著降低了仔豬飼糧中有機物質(zhì)、蛋白質(zhì)、鈣、磷的表觀消化率和蛋白質(zhì)生物學價值，25%污染的玉米飼糧對鈣的表觀消化率無影響，在被鐮刀菌毒素污染飼糧中添加EGM 0.2%吸附劑可使上述不良效應(yīng)得到改善，尤以在25%污染玉米飼糧中添加EGM吸附劑0.2%可獲得顯著的保護效應(yīng)[16]。因此，酵母細胞壁解毒的機理可能是葡甘露聚糖捕獲黃曲霉毒素，從而阻止了胃腸道對毒素的吸收，達到解毒的效果。

近年來，研究認為黃曲霉毒素B1是以乳酸菌-黃曲霉素復(fù)合體形式存在。Haskard等研究表明，氫鍵在乳酸菌-黃曲霉素復(fù)合體中不起作用，疏水相互作用是維持結(jié)構(gòu)的最主要作用[17]。Bolognani等研究認為形成的乳酸菌-黃曲霉素復(fù)合體后，黃曲霉素化學結(jié)構(gòu)沒變化，并具有較強的毒性[18]。李志剛等采用Ames試驗檢測被吸附的黃曲霉毒素B1的致突變性，乳酸菌-黃曲霉素復(fù)合體與自由黃曲霉毒素的回復(fù)突變無顯著差異[15]。盡管如此，形成的乳酸菌-黃曲霉素復(fù)合物仍可阻止黃曲霉素在動物體吸收，同時復(fù)合物較黃曲霉更容易排出體外，減少黃曲霉素對動物機體的危害[19]。

3.2 微生物的酶解作用

在玉米赤霉烯酮的脫毒研究中，Takahashi等發(fā)現(xiàn)螺旋聚孢屬中的Clonostachys rosea可將玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)化為另一種毒性較低的化合物，而其中起作用的是一種水解酶lactonohydrolase[20]。Liu等從Armillariella tabescens菌中分離出一種可以脫除黃曲霉毒素B1毒性的黃曲霉毒素脫毒酶（Afeatoxin detoxifizyme），通過該酶的處理，樣品中黃曲霉毒素的含量明顯減少，黃曲霉毒素特征熒光明顯減弱毒性，說明該酶是通過打開雙呋喃環(huán)破壞黃曲霉毒素[21]。目前在這一方面的研究還比較少，但隨著對脫毒微生物研究的深入，越來越多的微生物將被發(fā)現(xiàn)與霉菌毒素的脫毒有關(guān)，更深入的研究其脫毒機理可能會發(fā)現(xiàn)更高效、更易于應(yīng)用的細菌、酵母、霉菌、酶制劑。

4 展望

當前應(yīng)用的脫霉劑主要還是以物理吸附為主的無機物。有關(guān)微生物的脫霉研究主要集中在酵母及其細胞壁、乳酸菌等益生素類菌體對霉菌毒素的吸附作用，對微生物生物轉(zhuǎn)化及酶解作用的研究還很少。此后對微生物脫霉研究應(yīng)深入其生物轉(zhuǎn)化機理，更進一步的揭示其脫霉過程，研究出更高效的微生物脫霉產(chǎn)品。

[1] 徐劍宏,祭芳,陸瓊嫻,等.谷物真菌毒素的控制策略[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2007,23（6）:642-646.

[2] 侯然然,張敏紅.霉菌毒素對畜禽的危害及其防控方法的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,46（1）:13-14.

[3] 王繼彤,王有月,盧春香.飼料中霉菌和霉菌毒素的預(yù)防和去除方法[J].中國畜牧獸醫(yī),2004,31（10）:12-13.

[4] Moss M O,Long M T.Fate of patulin in the presence of the yeast saccharomyces cerevisiae[J].Food Additives&Contaminants,2002,19（4）:387-399.

[5] 孫建和,陸蘋,顧紅香.真菌毒素的微生物脫毒技術(shù)[J].微牛物學通報,2003,45（3）:60-63.

[6] Janos V,Zsanett P,Tabori K.Degradation of ochratoxin A and othermycotoxins by Rhizopus isoIates[J].Intemational Joumal of Food Micmbiology,2005,99（3）:321-328.

[7] Park K Y,Jung K O,Rhee SH,et al.Antimutagenic effects of doenjang（Korean fermented soypaste）and its active compounds[J].Mutat Res-cinogens,2003,523:43-53.

[8] Varga J,Kevei Y,Tóth,et al.Molecular analysis of variability within the toxigenic Aspergillus ochraceus species[J].Can JMicrobiol,2000,46（5）:593-599.

[9] Varga J,Péteri Z,Tabori K,et al.Degradation of ochratoxin A and othermycotoxins by Rhizopus isolate[J].International Journal of Food Microbiology,2005,99（3）:321-328.

[10] Fuchs E,Binder EM,Binder D,et al.Stmctural characterization of metabolites after the microbial degradation of type A trichothecenes by the bacterial stmin BBSH 797[J].Food Addit Contam,2002,19（4）:379-386.

[11] Volkl A,Vogler B,Schollenberger M,et al.Microbialdetoxmcation ofmycotoxin deoxynivalenol[J].JBasic Micmbi01,2004,44（2）:147-156.

[12] Line JE,Brackett R E.Factors affecting aflatoxin B1removal by flavobacterium aurantiacum[J].Journal of Food Protection,1995,58（6）:91-94.

[13] Nagendra S,Wu X R.Aflatocin B1binding abilities of probiotic bacteria[J].Bioscience Microflora,1999,18（1）:43-48.

[14] E1-Nezami H,Mykkanen H,Kankaanpaa P.Ability of lactobacillus and propionibacterium strains to remove flatoxin B,from the chicken duodem[J].Journal of Food Protection,2000,63（4）:549-552.

[15] 李志剛,楊寶蘭,姚景會,等.乳酸菌對黃曲霉毒素B1吸附作用的研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2003,15（3）:212-215.

[16] 蘇軍,陳代文,余冰,等.鐮刀菌毒素對斷奶仔豬的抗營養(yǎng)效應(yīng)及葡配甘露聚糖吸附劑的保護作用[J].中國畜牧雜志,2006,19:23-26.

[17] Haskard C,Binnion C,Ahokas J.Factors affecting the sequestration of aflatixin by Lactobacillu shamno susstrain GG[J].Chemic-Biological Interactions,2000,128（1）:39-49.

[18] Bolognani F,Rumney C J,Rowland IR.Influence of carcinogen binding by lactic acid-producong bacteria on tissue distribution and vivomutagenicitu of dietary carcinogens[J].Food and Chemical Toxicology,1997,35（6）:535-545.

[19] 艾連中,吳艷,張灝,等.益生菌對黃曲霉毒素的作用[J].食品科技,2004（9）:12-15.

[20] Takahashi-Ando N,Ohsato S,Shibata T,et al.Etabolism of zearalenone by genetically modified organisms expressing the detoxi-fication gene from clonostachys rosea[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70（6）:3 239-3 245.

[21] Liu D Y,Yao D S,Ling Y Q,et al.Production,purification,and characterization of an intracellular aflatixindeto-xifizyme from armillariella tabescens（E-20）[J].Food Chen Toxicol,2001,39（5）:461-466.