轉(zhuǎn)vip3基因作物研究進(jìn)展

李朋波，曹美蓮，楊六六，劉惠民，李燕娥

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030006）

商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物自從1996年問(wèn)世以來(lái)，在生產(chǎn)上已被廣泛地應(yīng)用。2009年，世界上有25個(gè)國(guó)家種植了1.34億hm2的轉(zhuǎn)基因作物，其中，以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米和油菜為主要種類[1-2]。除了我國(guó)具有絲氨酸蛋白酶抑制劑基因、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)基因棉花外，全世界范圍內(nèi)商業(yè)化應(yīng)用的主要抗蟲(chóng)基因是蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白基因[3]。轉(zhuǎn)Bt基因棉花在全球棉花生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。在我國(guó)，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉是應(yīng)用最成功、面積最廣的抗蟲(chóng)棉類型，1997—2009年，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉累計(jì)推廣面積達(dá)2 100萬(wàn)hm2，其中2009年達(dá)370萬(wàn)hm2，占全國(guó)棉花種植面積的68%[1]?？瓜x(chóng)棉的種植不僅有效控制了棉鈴蟲(chóng)對(duì)棉花的為害，而且高度抑制了棉鈴蟲(chóng)在玉米、大豆、花生和蔬菜等其他作物上的發(fā)生與為害[4]。

1 單一轉(zhuǎn)Bt基因作物的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)

Bt（Bacillus thuringiensis）基因是從蘇云金芽孢桿菌中分離的編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因，是目前研究最為深入、應(yīng)用范圍最廣的殺蟲(chóng)基因。然而，在全世界除轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)植物外，還有90%以上的微生物殺蟲(chóng)劑采用Bt制劑，因此，單一的殺蟲(chóng)毒蛋白就極有可能誘發(fā)害蟲(chóng)對(duì)Bt基因產(chǎn)生抗性。在田間生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，高劑量使用Bt殺蟲(chóng)劑的地方有一些鱗翅目害蟲(chóng)已經(jīng)產(chǎn)生了抗性，而實(shí)驗(yàn)室研究也表明，經(jīng)過(guò)多代的篩選，害蟲(chóng)產(chǎn)生了隱性的抗性基因[5-9]。長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花，害蟲(chóng)就可以對(duì)殺蟲(chóng)毒蛋白產(chǎn)生抗性。我國(guó)種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉已達(dá)十余年，在抗蟲(chóng)棉種植面積較大的棉區(qū)，棉鈴蟲(chóng)的抗性已提高5倍左右[10-12]。在國(guó)外，常采用種植非轉(zhuǎn)基因作物作為“庇護(hù)所”來(lái)延緩害蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性，但我國(guó)單個(gè)農(nóng)戶的種植面積比較小，采用種植非轉(zhuǎn)基因植物作為“庇護(hù)所”的方法在執(zhí)行上困難比較大，延緩害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生是一個(gè)長(zhǎng)期利用轉(zhuǎn)基因棉花的重要挑戰(zhàn)。同時(shí)，盡管Bt基因δ-內(nèi)毒素是有效的殺蟲(chóng)蛋白，但是在實(shí)際應(yīng)用中仍有許多重要農(nóng)作物害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)晶體蛋白毒素不敏感，如為害50多種農(nóng)作物的小地老虎。小地老虎取食棉苗，造成缺苗斷壟，往往給棉花生產(chǎn)帶來(lái)較大的損失，因此，對(duì)于其他害蟲(chóng)的控制也成為當(dāng)前抗蟲(chóng)棉培育的重要方向之一，利用具有不同于ICPs殺蟲(chóng)機(jī)理的新型殺蟲(chóng)蛋白發(fā)展抗蟲(chóng)棉是棉花生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。

2 VIP殺蟲(chóng)蛋白

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉問(wèn)世以來(lái)，科學(xué)家為了拓寬基因抗蟲(chóng)譜及提高抗蟲(chóng)性，對(duì)包括Bt基因家族在內(nèi)的其他類型的抗蟲(chóng)基因進(jìn)行了廣泛的研究，并取得了可喜的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，在蘇云金芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，可分泌另一種非δ-內(nèi)毒素的殺蟲(chóng)蛋白VIPs（Vegatative insecticidal protein，VIP）[13]。VIPs是芽孢桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌的一類新型殺蟲(chóng)毒素蛋白，被稱為第二代殺蟲(chóng)蛋白，主要分為VIP1，VIP2和VIP3等3種[14]。VIP1和VIP2構(gòu)成二元毒素，對(duì)鞘翅目葉甲科的昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)特異性[15]，而VIP3對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有較廣譜的殺蟲(chóng)活性[13]。

在VIP3中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)類型，其中，VIP3A蛋白最早由Estruch等報(bào)道，是一種廣譜殺蟲(chóng)蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)的VIP3A蛋白有8類[16]。VIP3A對(duì)小地老虎（Agrois ipsilon）有高殺活性，比毒蛋白Cry1Ac毒力高260倍；對(duì)草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、煙芽夜蛾（Heliothis virescens）、美洲棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa zea）、玉米螟（Pyrausta nubilalis）等鱗翅目害蟲(chóng)有較好殺蟲(chóng)活性[13，17]。一些研究表明，對(duì)不同的殺蟲(chóng)基因重組后表達(dá)的融合蛋白亦可增強(qiáng)對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的毒性，單獨(dú)的VIP3Ac1和VIP3Aa1對(duì)歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）殺蟲(chóng)活性極低，但將2個(gè)基因重組后表達(dá)了一種嵌合蛋白VIP3AcAa，則對(duì)歐洲玉米螟表現(xiàn)出很高的殺蟲(chóng)活性[18]。

VIP3與已知的ICPs沒(méi)有序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性[13]，ICPs對(duì)昆蟲(chóng)的毒殺作用主要是由于芽孢形成期產(chǎn)生的伴孢晶體導(dǎo)致的[19]；VIP3為可溶性蛋白，不需通過(guò)昆蟲(chóng)中腸的消化即可直接起作用，通過(guò)誘發(fā)中腸細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。VIP3與廣泛使用的Cry晶體殺蟲(chóng)毒素殺蟲(chóng)機(jī)理不相同，這是由于在鱗翅目昆蟲(chóng)中，VIP3的氨基肽酶N端與鈣黏蛋白類似物的受體不同于Cry1Ab或Cry1Ac[20]。通過(guò)比較VIP3對(duì)敏感和抗Cry1Ac的粉紋夜蛾的殺蟲(chóng)活性，VIP3Ab2，VIP3Aa1和VIP3AbAa對(duì)敏感和抗性昆蟲(chóng)都具有很高的殺蟲(chóng)活性[21]，且對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的煙芽夜蛾品系也表現(xiàn)對(duì)VIP3A蛋白的高度敏感性[22]，這說(shuō)明VIP3A和Cry1A這2種蛋白無(wú)交互抗性。因此，VIP3可用于抗性害蟲(chóng)的防治和研制構(gòu)建高效、廣譜的殺蟲(chóng)蛋白基因。

3 轉(zhuǎn)vip3基因作物研究與應(yīng)用

3.1 轉(zhuǎn)vip3基因作物的應(yīng)用進(jìn)展

先正達(dá)公司在全球最早開(kāi)展了vip3轉(zhuǎn)基因研究，已將vip3成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因殺蟲(chóng)植物的構(gòu)建，并在棉花和玉米中首先得到應(yīng)用。2003年研制成功表達(dá)VIP3A毒蛋白的棉花品種COT102，隨后又采用轉(zhuǎn)vip3A基因棉花COT102與轉(zhuǎn)cry1Ab基因棉花COT67B雜交選育而成VipCotTM棉花[23]，是首個(gè)含有VIPs和Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花。2007年培育出轉(zhuǎn)vip3Aa 20的轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162。目前，美國(guó)已成功培育含有VIP3A的玉米Agrisure VipteraTM3111[24]，是集合轉(zhuǎn)vip3A基因玉米Agrisure Viptera與抗蟲(chóng)、抗除草劑玉米Agrisure 3000GT的優(yōu)良性狀選育的新品種，這一品種可以非常有效地控制影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的14種地上及地下害蟲(chóng)，這在未來(lái)的玉米生產(chǎn)中必將發(fā)揮重要作用。2010年，先正達(dá)公司研制的含VIP3A蛋白的棉花和玉米獲得美國(guó)環(huán)境保護(hù)署的批準(zhǔn)[25-26]，可將含有VIP3A蛋白的轉(zhuǎn)基因作物用于防治對(duì)Bt基因產(chǎn)生抗性的鱗翅目害蟲(chóng)，同時(shí)，采用這種棉花和玉米還可以毒殺田間大多數(shù)的鱗翅目害蟲(chóng)，極大地拓寬了轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲(chóng)譜。預(yù)計(jì)到2011年，美國(guó)將開(kāi)始種植含有VIP3A蛋白的棉花品種和玉米雜交種。在國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)的資助下，我國(guó)也積極開(kāi)展了對(duì)vip3基因的研究與利用。浙江大學(xué)與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所等單位合作，利用國(guó)內(nèi)獲得的新型vip3基因及其改造成果，構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組vip3與cry1A融合基因，可望實(shí)現(xiàn)對(duì)棉花、玉米、水稻等主要作物鱗翅目害蟲(chóng)廣譜高抗的育種目標(biāo)。

3.2 轉(zhuǎn)vip3基因作物殺蟲(chóng)效果

轉(zhuǎn)vip基因植物可以提高植物的抗蟲(chóng)性，減少損失。Estruch等于1998年成功地將vip3A（a）基因與不同的啟動(dòng)子（如PEPC，Ubi和MTL等）構(gòu)建成表達(dá)載體，通過(guò)粒子轟擊法導(dǎo)入玉米愈傷組織，得到的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)小地老虎和草地夜蛾的殺蟲(chóng)效果都很好；后來(lái)又將轉(zhuǎn)vip3A基因玉米與轉(zhuǎn)cry1B基因、轉(zhuǎn)cry1Ab及轉(zhuǎn)cry9C基因玉米分別雜交，得到的雜交后代中有部分植株對(duì)歐洲玉米螟和草地夜蛾均有殺蟲(chóng)效果[17]。同時(shí)，vip3A基因也被轉(zhuǎn)化到棉花中。飼喂試驗(yàn)表明，vip3A對(duì)多種鱗翅目害蟲(chóng)表現(xiàn)了高的抗性[27]。大田接蟲(chóng)試驗(yàn)表明，含有VIP3A的棉花品系對(duì)甜菜夜蛾與草地夜蛾的毒殺作用強(qiáng)于Cry1Ab棉花品系，而對(duì)于煙芽夜蛾的作用則相反[28]。采用VIP3A與Cry1Ab共表達(dá)的棉花凍干組織進(jìn)行生測(cè)，結(jié)果表明，含4%的組織可完全毒殺煙芽夜蛾，含0.8%的組織飼喂幼蟲(chóng)平均死亡率達(dá)97.3%，2種濃度對(duì)棉鈴蟲(chóng)都具有100%的毒殺作用。由于大齡幼蟲(chóng)具有更高的耐受性，因此，采用1齡期和4齡期棉鈴蟲(chóng)飼喂VIP3A與Cry1Ab共表達(dá)的葉片，表明對(duì)這2種幼蟲(chóng)都具有100%的殺蟲(chóng)效果。大田接蟲(chóng)試驗(yàn)表明，7 d后轉(zhuǎn)基因棉花中煙芽夜蛾和棉鈴蟲(chóng)的死亡率達(dá)99.9%以上，完全抑制了害蟲(chóng)的發(fā)生[23]。將cry1Ab與vip3H融合基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因各個(gè)組織均可以表達(dá)Cry1Ab與VIP3H蛋白，表達(dá)量從多到少依次為葉片、莖稈、根和種子，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻在小規(guī)模田間試驗(yàn)時(shí)對(duì)稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medialis）具有良好的抗性[21]。

3.3 轉(zhuǎn)vip3基因作物對(duì)環(huán)境生物的影響

對(duì)于新型轉(zhuǎn)基因作物的出現(xiàn)，人們關(guān)注的另外一個(gè)焦點(diǎn)問(wèn)題是轉(zhuǎn)VIP3基因作物對(duì)環(huán)境生物是否安全。采用轉(zhuǎn)VIP3A基因玉米飼喂肉雞試驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)49 d的喂養(yǎng)，VIP3A對(duì)公雞與母雞宰殺產(chǎn)量沒(méi)有明顯影響，臨床血液學(xué)分析也沒(méi)有因飼喂轉(zhuǎn)vip3A基因玉米而產(chǎn)生影響[29]。通過(guò)研究轉(zhuǎn)基因玉米田的節(jié)肢動(dòng)物群落，表達(dá)VIP3A蛋白的玉米田中非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物整體的生物多樣性和群體水平與常規(guī)玉米沒(méi)有顯著的差異，然而，在轉(zhuǎn)Bt基因玉米田卻有部分物種發(fā)生了顯著的改變[30-31]。而對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)環(huán)境生物和人類健康均無(wú)明顯的影響[32]。從現(xiàn)有研究結(jié)果看，轉(zhuǎn)vip3基因植物對(duì)人類、家禽及田間非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物不具有危害性的影響，可以安全地用于作物害蟲(chóng)的防治。

綜上所述，轉(zhuǎn)Bt基因棉花、玉米等作物為防治棉鈴蟲(chóng)與玉米螟等害蟲(chóng)起到了重要作用，新型轉(zhuǎn)vip3基因作物具有防治對(duì)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性的害蟲(chóng)及擴(kuò)大抗蟲(chóng)譜的優(yōu)勢(shì)，為了延長(zhǎng)轉(zhuǎn)Bt基因作物的田間應(yīng)用壽命，應(yīng)該進(jìn)一步研究2種轉(zhuǎn)基因作物的科學(xué)合理搭配種植方案，降低轉(zhuǎn)基因作物“失效”的風(fēng)險(xiǎn)，確保作物安全高效生產(chǎn)。

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