轉(zhuǎn)基因作物安全性及外源基因加工降解研究進展

朱占齊 王衛(wèi)國

1 轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展概況

轉(zhuǎn)基因作物的研究始于20世紀(jì)80年代初期。1996年，美國最早開始大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)和銷售轉(zhuǎn)基因作物(包括大豆、玉米、油菜、土豆和西紅柿)，當(dāng)年世界轉(zhuǎn)基因作物種植總面積為170萬公頃。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用推廣站(ISAAA)信息，截止2008年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積連續(xù)13年持續(xù)增長，年種植面積增加了72.5倍，即從0.017億公頃增長至1.250億公頃，較2007年（種植面積1.143億公頃），同比增長9.4%，占全球作物種植總面積（15億公頃）的8%。如果把使用多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的作物計算在內(nèi)，涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的作物種植面積（性狀種植面積）達(dá)到1.66億公頃，全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積達(dá)到8億公頃。

1996年至2008年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植國家從6個增加到25個，其中發(fā)展中國家15個，發(fā)達(dá)國家10個。其中有10個國家種植了復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物。種植面積超過100萬公頃的有8個國家，中國排第6名，種植面積達(dá)到380萬公頃，中國種植的轉(zhuǎn)基因作物包括棉花、番茄、楊樹、牽?；ā⒖共《灸竟虾吞鸾?。農(nóng)業(yè)部2009年已頒發(fā)了兩種轉(zhuǎn)基因水稻和一種轉(zhuǎn)基因玉米的生物安全證書。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用和推廣，越來越多的國家和地區(qū)采納轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行商業(yè)化生產(chǎn)，轉(zhuǎn)基因作物的市場價值逐年增長。1996年轉(zhuǎn)基因作物全球市場價值為2.35億美元，到2008年激增到84億美元。據(jù)ISAAA2008年度報告顯示，自轉(zhuǎn)基因作物大面積商業(yè)化種植的13年以來，全球轉(zhuǎn)基因作物市場價值累計為440億美元。轉(zhuǎn)基因作物全球市場價值是根據(jù)Bt種子銷售價加上所有適用技術(shù)之費用進行計算的。專家預(yù)計2015年全球轉(zhuǎn)基因作物的潛在收益將達(dá)到2100億美元。可見，轉(zhuǎn)基因商業(yè)化生產(chǎn)能夠帶來巨大的經(jīng)濟利益和其廣闊的前景。

轉(zhuǎn)基因作物的外源基因可分為三大類:第一類是輔助轉(zhuǎn)化基因，包括報告基因和抗生素抗性基因等;第二類為改良植物性狀的目的基因，如抗病毒、抗蟲、抗除草劑和品質(zhì)、性狀、育性改變基因等;第三類為調(diào)控目的基因表達(dá)的序列，如啟動子、終止子和增強子序列等。這類轉(zhuǎn)基因作物主要具有抗除草劑性、抗病性和抗蟲性，稱為“輸入性狀”，轉(zhuǎn)入基因的功能是改良農(nóng)藝性狀，得益的是農(nóng)民和開發(fā)商。在商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物中，抗除草劑一直是其最主要的特性，其次是抗蟲性，再次是混合型特性（抗蟲和耐除草劑等）。2008年，混合型特性品種的種植面積超過抗蟲性品種，這表明多種特性的轉(zhuǎn)基因作物將成為未來發(fā)展的重點。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，第二代轉(zhuǎn)基因作物將不斷開發(fā)“輸出性狀”，重點在改良品質(zhì)，增加營養(yǎng)，或使食品具有醫(yī)療保健功能，或用作環(huán)保和工業(yè)原料，從而大幅度增加農(nóng)副產(chǎn)品的附加值，并使消費者直接得益，如富含維生素A的金米稻，高賴氨酸或高油玉米，高油酸大豆，以及生產(chǎn)可降解塑料等的轉(zhuǎn)基因植物等。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在國際貿(mào)易中帶來的巨大商業(yè)利益，轉(zhuǎn)基因生物安全問題成為世界關(guān)注的熱點，引起了政府間、學(xué)術(shù)界的爭論。轉(zhuǎn)基因作物對人類、動植物、微生物和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成的危險或潛在的風(fēng)險，主要涉及環(huán)境安全和食品安全。

2 國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因作物所持態(tài)度

基于對轉(zhuǎn)基因作物生物安全的關(guān)注，一些國際性組織及各個國家都紛紛采取行動，制定了相應(yīng)的管理措施。經(jīng)濟與合作組織 (OECD)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織(WHO)、聯(lián)合國開發(fā)署(UNDP)、聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)、國際生命科學(xué)學(xué)會(ILSI)都積極地參與生物技術(shù)的安全性管理和國際協(xié)調(diào)工作。制定和提出了相應(yīng)的風(fēng)險管理法規(guī)、規(guī)則和辦法，以規(guī)避可能的健康和環(huán)境風(fēng)險。許多國家都制定了詳細(xì)而嚴(yán)格的生物安全管理方面法規(guī)和政策，以規(guī)范轉(zhuǎn)基因作物的研究、開發(fā)、田間試驗、環(huán)境釋放、商業(yè)化生產(chǎn)的整個過程。并對涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品相關(guān)的國際貿(mào)易、知識產(chǎn)權(quán)、標(biāo)簽政策等方面的問題給予了關(guān)注。

歐洲是最早為轉(zhuǎn)基因食品采取標(biāo)識制度的地區(qū)，從1997年開始，歐盟要求各成員國監(jiān)管食物銷售(特別針對各類轉(zhuǎn)基因或含轉(zhuǎn)基因成分食物)及實行標(biāo)識制度，并且要求越來越嚴(yán)格，2001規(guī)定凡含有0.9%以上轉(zhuǎn)基因DNA或蛋白質(zhì)的農(nóng)作物或食品，在市場銷售時，必須帶有“GMO”(轉(zhuǎn)基因)字樣的標(biāo)簽。2002年7月，要求在不考慮含量多少的情況下，對所有含轉(zhuǎn)基因成分的農(nóng)作物或食品都進行明確標(biāo)識。此外，歐洲議會還建議加強對轉(zhuǎn)基因污染事故的通報制度。2010年3月2日，歐盟委員會則首次批準(zhǔn)商業(yè)種植由德國化工企業(yè)研制的轉(zhuǎn)基因土豆。盡管這一裁決依然充滿爭議，但卻被認(rèn)為是歐盟委員會對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物立場的轉(zhuǎn)變，意義特殊。此前，僅有少量轉(zhuǎn)基因玉米在歐盟成員國內(nèi)種植。

進入21世紀(jì)，亞洲各國也制定了適合本國國情的轉(zhuǎn)基因作物管理制度，要求將轉(zhuǎn)基因食品納入監(jiān)管，所有轉(zhuǎn)基因食物必須貼標(biāo)簽，并且規(guī)定必須注明轉(zhuǎn)基因成分，所有轉(zhuǎn)基因食品必須經(jīng)過安全檢驗。有些國家設(shè)立了GMO標(biāo)簽法。在加強管理的前提下，部分國家也分別制定頒布了本國的基因工程法律或準(zhǔn)則。2000年4月，日本曾禁止進口美國轉(zhuǎn)基因大豆，2009年10月，印度政府下屬的基因工程批準(zhǔn)委員會批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因茄子的商業(yè)種植。此后，反對聲不斷。2010年2月9日，印度環(huán)境部長拉梅什宣布，禁止商業(yè)種植轉(zhuǎn)基因茄子。

我國對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品采取積極而謹(jǐn)慎的態(tài)度，一方面充分肯定轉(zhuǎn)基因作物對于促進發(fā)展中國家的農(nóng)業(yè)發(fā)展和解決糧食問題的重要性，并積極支持轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用；另一方面對轉(zhuǎn)基因作物的研究開發(fā)和應(yīng)用實行嚴(yán)格的安全審查和管理制度。自1993年以來，也陸續(xù)出臺了一系列相關(guān)的政策和法規(guī)，以加強對轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品的安全性管理，尊重消費者的知情權(quán)和自由選擇權(quán)。目前我國轉(zhuǎn)基因食品法規(guī)主要有：1993年國家科委頒布《基因工程安全管理辦法》、2001年5月9日實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、2002年3月20日起實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評估管理辦法》，第一次將轉(zhuǎn)基因從低到高分為4個等級。2002年3月20日起實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，規(guī)定對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實施標(biāo)識制度。2002年4月8日頒布，7月1日起實施《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》，2004年6月12日頒布《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》。

轉(zhuǎn)基因作物的標(biāo)識管理制度的建立，對于保持生態(tài)環(huán)境、確保人類健康和動植物安全、保護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)具有重要意義。

3 轉(zhuǎn)基因作物安全性問題

目前，有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境可能產(chǎn)生的影響主要有以下幾方面：轉(zhuǎn)基因作物或其親緣野生種可能變?yōu)殡s草；轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生新的病毒疾病，使目標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性；非目標(biāo)生物受到危害、破壞生物多樣性、影響生態(tài)系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)基因作物或其親緣野種可能變?yōu)殡s草，而破壞生態(tài)平衡。部分栽培作物，當(dāng)被插入一個如抗病、抗蟲基因時，如果其外源逃逸，可能會使其作物自身的穩(wěn)定性發(fā)生改變，而趨向于雜草化。轉(zhuǎn)基因作物對非目標(biāo)生物的傷害，可能會影響生物的多樣性。Losey等（1999）和Birch等（1996）研究表明，大規(guī)模種植抗蟲轉(zhuǎn)基因作物會使昆蟲種群減少，進而影響生物的多樣性。除草劑的過量施用還可能造成一些非主要作物受到傷害甚至滅絕，從而引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，昆蟲、鳥類、哺乳動物最終成為受害者。

研究表明，轉(zhuǎn)基因棉花Bt基因流在陸地棉品種間以及陸地棉和海島棉間發(fā)生了轉(zhuǎn)移。一些抗病毒基因逃逸到其他土壤微生物也可能產(chǎn)生新的致病性病毒。而且由于導(dǎo)入外源目的基因，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)突破了傳統(tǒng)的界、門概念，具有普通物種不具備的優(yōu)勢特征。作為外來品種進入自然生態(tài)系統(tǒng)，往往具有較強的“選擇優(yōu)勢”，可能會影響植物基因庫的遺傳結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致野生等位基因的丟失而淘汰原來棲息地上的物種和其它遺傳資源，乃至影響農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中有益天敵生物的種類和種群數(shù)量，使生物多樣性喪失。

對于轉(zhuǎn)基因食品安全性，爭論的熱點包括:①轉(zhuǎn)基因作物中的外源基因是否可能引起動物和人的過敏反應(yīng)；②抗蟲轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品中的殺蟲蛋白、蛋白酶活性抑制劑和殘留的抗昆蟲內(nèi)毒素是否會危害人和動物的健康；③抗病毒轉(zhuǎn)基因作物中導(dǎo)入的病毒外殼蛋白基因可能對人和動物的健康產(chǎn)生危害；④抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的推廣可能導(dǎo)致除草劑在環(huán)境中殘留量增高進而污染食品和飼料；⑤轉(zhuǎn)基因作物中的抗性基因是否會轉(zhuǎn)移；⑥飼喂轉(zhuǎn)基因飼料的動物產(chǎn)品(肉、蛋、乳等)是否安全；⑦轉(zhuǎn)基因食品營養(yǎng)品質(zhì)的改變是否對人體健康不利。

當(dāng)目的基因的產(chǎn)物如果是潛在的過敏原，則該轉(zhuǎn)基因食品有可能引起人體的過敏反應(yīng)。在對轉(zhuǎn)基因食品進行安全性評價時，過敏誘發(fā)性是個相當(dāng)重要的因素。在已被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物食品中，外源基因編碼蛋白的過敏性均已經(jīng)過相關(guān)審查。如Nebraska大學(xué)食品科技系證明，表達(dá)巴西堅果2 S清蛋白的大豆有過敏性，這是迄今已知轉(zhuǎn)基因植物未被批準(zhǔn)商業(yè)化的例子。若轉(zhuǎn)基因食品中含對部分人群有過敏性反應(yīng)的蛋白，則需加標(biāo)簽，以使購買者做出選擇。

一些人認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因食品中存在一些具有抗生素抗性的標(biāo)記基因，有可能在動物腸道中轉(zhuǎn)移給微生物，食用這些產(chǎn)品可能會使飼養(yǎng)動物和人體具有抗生素抗性，從而影響抗生素治療的效果。但也有人認(rèn)為，食物中的基因轉(zhuǎn)移到腸道微生物的可能性極小，而食物中的遺傳物質(zhì)也不會轉(zhuǎn)移到人體中。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的目的基因可能帶來的另一不安全因素是可能引起食品的營養(yǎng)成分或品質(zhì)發(fā)生改變，甚至產(chǎn)生一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，對人體健康產(chǎn)生不良影響。另外，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的目的基因在表達(dá)時，可能會促使一些天然毒素的表達(dá)率提高，如豆科蛋白酶抑制劑、馬鈴薯的茄堿等，也會帶來不利影響。

美國食品及藥物管理局(FDA)明確提出，轉(zhuǎn)基因作物的DNA片段很可能會被哺乳動物細(xì)胞攝入。英國官方則指出，轉(zhuǎn)基因的DNA不但可通過攝食轉(zhuǎn)移，而且可在食品加工和農(nóng)場工作時通過接觸粉塵、花粉轉(zhuǎn)移。2004年6月，德國研究人員首次在用轉(zhuǎn)基因飼料喂養(yǎng)的奶牛產(chǎn)出的奶中，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因作物的DNA片斷。美國研究機構(gòu)進行了20多項轉(zhuǎn)基因飼料對畜禽的試驗，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因飼料對畜禽的生長性能、健康狀況及肉、蛋、奶組分產(chǎn)生影響，在肉、蛋、奶中也未檢出轉(zhuǎn)基因蛋白和轉(zhuǎn)基因DNA?？梢婈P(guān)于這個問題，并無定論。

轉(zhuǎn)基因食品經(jīng)過不同的加工程序，轉(zhuǎn)基因的DNA片段將發(fā)生不同程度的降解和斷裂（陳穎等，2005），從而直接影響到最初的轉(zhuǎn)基因成分在最終產(chǎn)品中的含量和作用，所以在分析評估轉(zhuǎn)基因食品安全問題的時候應(yīng)該充分考慮到食品實際加工過程，同時還應(yīng)考慮最終到消費者消化道中的轉(zhuǎn)基因片段在人體內(nèi)的反應(yīng)等因素。轉(zhuǎn)基因食品（飼料）的安全性目前仍存在爭議，需要長時間觀察才能得出結(jié)論。

4 轉(zhuǎn)基因作物外源基因加工降解研究進展

國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物外源基因加工降解定性研究的報道目前已有許多，總結(jié)歸納如下：外源目的基因相對于內(nèi)源基因來說基因片段較少，在高溫、高壓、酸堿處理、酶解、發(fā)酵和剪切力等物理、化學(xué)及生物變化影響下,會隨著基因組DNA的降解而降解（金紅等，2003）。王衛(wèi)國等（2004）認(rèn)為，不同飼料加工方法對飼料DNA的降解作用不同。粉碎、配料、混合、普通制粒工藝、青貯不能有效降解飼料DNA。而充足時間的高溫、高壓加工可有效降解飼料DNA。Chiter等(2000)對飼料中的一些植物性原料，如榨油前及榨油后的油菜、亞麻籽、大豆、小麥粉、新鮮的玉米粉和玉米粒、甜菜及甜菜漿中DNA的穩(wěn)定性進行了研究。結(jié)果表明，高溫和高壓蒸汽可降解小麥和玉米粉中的基因組DNA和Rubisco SS基因。

Sarah R.Murray等(2007)使用實時熒光PCR技術(shù)對玉米內(nèi)源基因 (葉綠體的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因及細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因)在蒸煮、擠壓時的含量變化進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)玉米粉在100℃下蒸煮60 min以后,DNA含量驟然下降,特別是細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因。對玉米渣進行擠壓試驗時,當(dāng)設(shè)定溫度60℃時DNA變化不明顯,而當(dāng)設(shè)定溫度170℃時DNA顯著減少。當(dāng)設(shè)定扭矩6 nm時,擠壓溫度170℃時與擠壓溫度60℃時相比，小片段的DNA含量明顯減少。扭矩36 nm的情況下,3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的68 bp片段和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因的97 bp片段幾乎不能檢測出來,該研究表明,溫度和機械力都對DNA降解有影響,更重要的是溫度和機械力的復(fù)合作用是正向加強的。

Bauer(2003)研究了加工溫度、pH值對食品中DNA降解的影響。用高效液相色譜（HPLC）法能夠定量鑒別閉環(huán)的和刻痕的質(zhì)粒DNA，在緩沖液中質(zhì)粒DNA的刻痕隨pH值的降低而顯著增強。事實上，在番茄漿液中也觀察到了相同的降解率。溫度和pH值的復(fù)合作用是正向加強的。對于在緩沖液中的轉(zhuǎn)基因玉米DNA達(dá)957 bp的片段在處理時間≤90 min、65℃、pH值4.0的條件下仍可檢測出。Gawienowski等（1999）研究表明，經(jīng)浸泡、濕磨等加工過程能使玉米基因和質(zhì)粒DNA降解，135℃加熱2 h后，DNA幾乎完全降解。而Kharazmi等（2003）認(rèn)為，浸泡后又經(jīng)過物理破碎處理而做成的豆奶、豆腐和熱加工做成的玉米糊和馬鈴薯，沒有檢測出大于1.1 kb的DNA片段。

沈立明等（2006）利用針對潮霉素標(biāo)記基因（hpt）不同大小片段的PCR擴增體系，對hpt在轉(zhuǎn)基因大米加工食品中的穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果顯示，加工米飯、粥大于500 bp的片段已降解，僅能擴增出植物葉綠體基因rbcl片段，爆米花和鍋巴大于236 bp的hpt片段已降解，所有擴增均為陰性。hpt在轉(zhuǎn)基因大米加工食品中均已不同程度的發(fā)生了降解，不同加工方式對hpt片段降解影響顯著，在加工后hpt以較大或完整片段向食品或消化道微生物轉(zhuǎn)移的可能性減小。

覃文等（2003）為確定加工過程如加熱溫度和時間對PCR定量檢測的影響程度，將玉米粉經(jīng)由不同溫度和時間處理后，提取DNA并進行定量檢測。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過加熱處理后，加入到PCR反應(yīng)體系的外源基因DNA模板量受加熱的溫度和時間影響很大，加熱溫度越高、時間越長，Ct（循環(huán)次數(shù)）值越大，但對于內(nèi)源參照基因檢測的影響不明顯;當(dāng)加熱溫度高且時間長(121℃、30 min)時，PCR反應(yīng)也不穩(wěn)定，表現(xiàn)Ct值變化較大。由此說明DNA被破壞嚴(yán)重時，目標(biāo)DNA量越少，對PCR反應(yīng)的影響越大，此時若要得到理想且穩(wěn)定的檢測結(jié)果，在檢測加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分時，應(yīng)適當(dāng)增加加入到PCR反應(yīng)體系中的目標(biāo)DNA。

Anklam(2002)和 Yamaguchi(2003)等研究發(fā)現(xiàn)，酸性pH值對DNA的磷酸鍵產(chǎn)生破壞，從而造成DNA的降解。青貯加工是最簡單的飼料加工方式，經(jīng)過對青貯飼料的檢測，發(fā)現(xiàn)其中的DNA保持完整，說明這種加工方式對DNA的降解無明顯作用。然而Hupfer等研究認(rèn)為，青貯為加速DNA降解提供了一種促進條件，經(jīng)過長期貯存后，基因保持完整并保留功能的可能性很小。

陳穎等（2005）研究表明，外源基因EPSPS在3種大豆加工食品的各個工藝過程中均會受到不同程度的破壞和影響。在豆腐、豆奶、豆粉的加工過程中，片段大小為1512及807 bp的外源基因僅能在原料中檢測到。當(dāng)原料經(jīng)過磨漿后，EPSPS基因的片段大小驟然降至800 bp以下，點漿、加熱等工藝又使得外源基因繼續(xù)降解至400 bp左右，隨著擠壓成型、高溫殺菌及噴霧干燥工藝的完成，3種大豆產(chǎn)品中目的基因片段大小僅為190 bp左右。

本實驗室通過設(shè)計擠壓膨化處理轉(zhuǎn)抗草甘膦基因大豆試驗，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為100℃時，擠壓膨化對外源基因的降解作用并不明顯；在溫度為115℃的擠壓條件下，EPSPS基因的片段大小降至807 bp，其外源基因僅能檢測到408 bp大小的片段，當(dāng)擠壓溫度達(dá)到130℃時，外源基因片段驟然降至206 bp以下，基因組電泳結(jié)果表明，溫度越高，基因組濃度越低，拖尾現(xiàn)象越嚴(yán)重。擠壓膨化包括高溫、高壓以及機械剪切，使外源基因在不同的擠壓工藝加工過程中受到不同程度的降解。對外援基因降解而言，擠壓膨化溫度是主要的影響因素，其次為剪切作用，二者的復(fù)合作用是正向加強的。