EOLA1基因在 DA大鼠移植肝臟急性排斥反應(yīng)中表達(dá)的初步研究*

冉崇福,竇科峰,劉少山,鄭仲謹(jǐn),梁自文,劉永康

(1.解放軍第四五二醫(yī)院肝膽科,四川 成都 610021;2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽科,陜西 西安 710032;3.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院,重慶 400038)

近年梁自文等[1-3]在研究燒傷、創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)狀態(tài)時(shí),發(fā)現(xiàn)一種人內(nèi)皮細(xì)胞活化新基因 EOLA1,并顯示出 EOLA1參與了炎癥反應(yīng)過程,在富血管組織有高表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),EOLA1在人類肝臟組織也有較高表達(dá),參與了血管的修復(fù)和炎癥時(shí)細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)[3]。肝臟移植急性排斥反應(yīng)最常見的是表現(xiàn)為免疫排異引起的肝內(nèi)嚴(yán)重炎癥反應(yīng),新基因 EOLA1是否參與了急性免疫排斥所引起的肝內(nèi)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)過程、起著什么樣的作用還不清楚,為此,本實(shí)驗(yàn)通過建立近交系大鼠同種異體原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型(DA→Lewis),對(duì)新基因 EOLA1在 DA大鼠移植肝臟急性排斥反應(yīng)時(shí)的表達(dá)情況做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:雄性近交系 DA大鼠 30只和 Lewis大鼠 90只,體重 200-220g,分別購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心、北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。本研究分為 A、B兩組,A組 30例:Lewis→Lewis大鼠肝臟移植作為移植耐受組做對(duì)照;B組30例:DA→Lewis大鼠肝臟移植急性排斥反應(yīng)模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及器材:凝膠回收試劑盒,Promega公司;PCR回收試劑盒,Roche公司;RT-PCR試劑盒,TaKaRa公司;全自動(dòng)生化分析儀(Becman公司,CX-7);Du-640紫外分光光度計(jì),美國 Beckman;PCR儀 ,美國 M.J.。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 移植模型建立:大鼠肝臟移植模型的建立按照改良“二袖套”法完成[4]。A組:移植耐受組(n=30),選用 Lewis大鼠 60只,30只為供體,30只為受體,建立 30例肝臟移植耐受模型;B組:急性排斥組(n=30),選用 DA大鼠 30只為供體,Lewis大鼠 30只為受體,建立 30例肝臟移植急性排斥模型。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法:①大鼠原位肝移植術(shù)后的生存時(shí)限,每組 5只觀察移植術(shù)后平均存活天數(shù)。②肝功能檢查 分別于術(shù)后 1、3、5、7、10天處死大鼠,經(jīng)腹主動(dòng)脈抽血2 ml離心后取上層血清測(cè)ALT、TBIL。 ③病理學(xué)檢查 分別于術(shù)后 1、3、5、7、10天處死大鼠,取部分新鮮肝組織,福爾馬林固定 24小時(shí),常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素 -伊紅(HE)染色后鏡檢。④移植肝組織 EOLA1基因的表達(dá) Western blot檢測(cè)移植肝組織 EOLA1的表達(dá),每組于術(shù)后 1、3、5、7、10天處死大鼠,取部分新鮮肝組織液氮保存。提取總蛋白,以變性總蛋白進(jìn)行 Western blot檢測(cè),每次電泳均包含各組,一抗為前期制備的抗EOLA1多抗[5],二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG工作液,檢測(cè)術(shù)后 1、3、5、7、10天 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 EOLA1水平。用 ECL系統(tǒng)軟件半定量分析,計(jì)算各組平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)分析均通過 SPSS 10.0進(jìn)行。計(jì)量數(shù)據(jù)以 (x-±s)表示,組內(nèi)與組間樣本均數(shù)兩兩比較采用 t檢驗(yàn),p＜0.05為差異顯著,p＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝移植術(shù)后一般情況的觀察:大鼠肝移植60例次,平均手術(shù)時(shí)間 90分鐘,無肝期(14.0±2.5)秒。手術(shù)死亡 1例,術(shù)后肝上下腔靜脈出血 1例,門靜脈出血 1例。A組平均生存時(shí)間超過 100天,B組平均存活時(shí)間(16.2±1.4)天;兩組比較相差非常顯著(p＜0.01)。

2.2 肝功能檢查:A組大鼠肝移植術(shù)后第 1天ALT、TBIL有輕度增高,至第 3天降至正常。B組第1天開始 ALT、TBIL逐漸升高,第 10天達(dá)到高峰,兩組比較相差非常顯著(p＜0.01)。

2.3 移植肝組織 EOLA 1的表達(dá):術(shù)后 1、3、5、7、10天 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 EOLA1水平,A組移植肝組織 EOLA1表達(dá)高,B組較低(見圖 1);A、B兩組術(shù)后 5個(gè)時(shí)間點(diǎn) EOLA1表達(dá)的灰度值比較,相差非常顯著(見圖2 p＜0.01)。

2.4 病理學(xué)檢查:A組未見明顯的病理損害;B組術(shù)后第 5天開始出現(xiàn)匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤,第 10天明顯加重,可見匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量的單核淋巴細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞壞死,出現(xiàn)靜脈內(nèi)皮炎和膽管上皮炎,膽管上皮細(xì)胞可出現(xiàn)變性、壞死及脫落,甚至可見炎性浸潤擴(kuò)展至肝實(shí)質(zhì)。

3 討 論

近交系大鼠 DA→LEW是國際上比較公認(rèn)的肝移植急性排斥動(dòng)物模型,具有研究周期短、模型穩(wěn)定、病理改變典型、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),因此本實(shí)驗(yàn)在 Kamada建立的“雙袖套”法的基礎(chǔ)上,改良建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:耐受組移植術(shù)后血清ALT和TBIL以及移植肝臟組織病理基本正常,無明顯的排斥反應(yīng);排斥反應(yīng)組術(shù)后第 5天血清 ALT和TBIL開始出現(xiàn)升高、第 10天達(dá)到高峰,移植肝臟組織病理第 5天出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤、且隨著時(shí)間而加重,第 10天匯管區(qū)更加嚴(yán)重出現(xiàn)明顯的血管內(nèi)皮炎和膽管上皮炎、炎細(xì)胞侵犯到肝實(shí)質(zhì)、肝細(xì)胞片狀壞死,參照人排斥反應(yīng)的 Banff標(biāo)準(zhǔn),符合急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn),能滿足本實(shí)驗(yàn)的要求[4,6]。

本實(shí)驗(yàn)大鼠肝移植術(shù)后 EOLA 1的表達(dá)耐受組與急性排斥組相差非常顯著,從術(shù)后 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)分析,急性排斥組大鼠移植肝臟組織隨著時(shí)間的延長,免疫排斥反應(yīng)越嚴(yán)重、移植肝臟組織炎性反應(yīng)和組織壞死越明顯,但 EOLA1的表達(dá)水平相比耐受組低下,EOLA1表達(dá)水平的高低與移植肝組織內(nèi)急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度存在一定程度的負(fù)相關(guān),即排斥反應(yīng)越重 EOLA1的表達(dá)越低。

EOLA 1是人內(nèi)皮活化相關(guān)新基因,前期研究發(fā)現(xiàn) EOLA1與細(xì)胞內(nèi)抗金屬硫蛋白 2A(metallothio-nein 2A,MT2A)發(fā)生相互作用,而 MT2A廣泛分布于各組織細(xì)胞,具有多種重要的生理功能,主要參與金屬代謝、對(duì)抗內(nèi)毒素脂多糖(LPS)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等。EOLA 1與 MT2A相互作用參與了對(duì)細(xì)胞生長的影響,因?yàn)楫?dāng)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高表達(dá) EOLA1后,細(xì)胞增殖明顯加強(qiáng),但是,在炎癥刺激時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) EOLA1增高,與胞內(nèi)蛋白 MT2A發(fā)生相互作用,這種作用信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi),調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞的生長,有助于血管的修復(fù)和炎癥時(shí)細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)[1,2,3,7]。

新基因 EOLA1在體內(nèi)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中具有保護(hù)調(diào)節(jié)作用[7],結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè) EOLA1在肝臟組織中也可能發(fā)揮了抗排斥和保護(hù)肝內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及移植肝細(xì)胞的作用。

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[3] 梁自文,楊宗城,羅向東,等.內(nèi)皮細(xì)胞活化相關(guān)新基因 EOLA 1的亞細(xì)胞定位及組織表達(dá)[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2004,29(4):342-344

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[5] 梁自文,王清良,楊宗城,等.EOLA 1抗體的制備及腫瘤組織中EOLA 1的表達(dá)檢測(cè)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(24):2418-2420

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