兔 VX2肝癌動物模型的建立*

楊 林,李祖茂,周翔平

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,四川 南充 637000;3.四川大學(xué)華西醫(yī)院放射科,四川 成都 610041)

原發(fā)性肝癌(p rimary hepatic carcinoma,PHC)的發(fā)病率在世界各地均呈上升趨勢,也是我國常見的惡性腫瘤之一。PHC手術(shù)切除率僅 20%,在 PHC的非手術(shù)療法中,介入治療占有及其重要的地位。如何提高肝癌介入治療的遠(yuǎn)期療效仍是臨床面臨的重要課題。肝癌介入治療的實驗研究需要借助動物模型來完成。既往肝癌動物模型多采用化學(xué)藥物誘導(dǎo)法建立在大鼠身上,該法具有誘導(dǎo)時間長和成瘤率低等缺點。另外,采用大鼠肝癌動物模型進(jìn)行數(shù)字減影血管造影(diagnostic digital subtraction angiography,DSA)及肝動脈化療栓塞(chemoembolization)治療的研究多需開腹行肝動脈插管,操作較為復(fù)雜,動物死亡率較高。兔 VX2腫瘤是由 Shope等[1]使用病毒在兔皮膚誘導(dǎo)出的乳頭狀瘤,經(jīng) 72次傳代培養(yǎng)后,建立起來的鱗癌細(xì)胞株。由于兔缺乏針對該腫瘤的抗體,故此鱗癌極易在兔體內(nèi)生長,常接種到兔的肝臟和腎臟等部位,制作原位腫瘤模型。本文介紹應(yīng)用 VX2腫瘤組織塊制作兔移植性肝癌模型方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物:雄性新西蘭大白兔 26只(平均體重2.0 kg),由四川大學(xué)華西實驗動物中心提供(合格證號:10)。荷瘤兔由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院馮敢生教授惠贈。

1.2 藥物:10%水合氯醛;安定(天津金耀氨基酸有限公司);8%硫化鈉;優(yōu)維顯 300(廣州先靈公司);青霉素(華北制藥股份有限公司);慶大霉素(樂山三九長征藥業(yè)股份有限公司);聚維酮碘溶液(成都永安制藥有限公司)。

1.3 設(shè)備:PHILIPS Brilliance 64層螺旋 CT(荷蘭);MEDRADRSTELLANTTMCT 211高壓注射器(美國 MEDRAD公司);SIEMENS AXIOM Artis FA DSA(德國)。

1.4 肝癌動物模型的建立:腫瘤移植手術(shù)由同一組醫(yī)師(1名高年資外科主治醫(yī)師,2名住院醫(yī)師)進(jìn)行。將大腿攜有 VX2鱗狀細(xì)胞癌的荷瘤兔全麻(10%水合氯醛 2.5ml/kg,安定 2.5mg/kg,腹腔注射),無菌條件下剝離腫瘤,切取靠近包膜的灰白色魚肉樣腫瘤組織,剔除壞死組織及纖維組織,用眼科剪將腫瘤組織剪碎至 2mm左右大小的瘤塊,置于盛有生理鹽水的無菌培養(yǎng)皿中備用。實驗兔全麻(用藥及劑量同前)后,仰臥固定于手術(shù)臺上,手術(shù)野常規(guī)剪毛,8%硫化鈉脫毛,消毒鋪巾,取上腹正中切口,長約 2cm,逐層切口開腹壁各層,暴露肝臟,以平鑷將肝左外葉拉出體外,于其組織較厚處,以眼科剪作一長約 3mm的小切口,經(jīng)切口在肝內(nèi)潛行分離,形成一個 3mm×5mm大小的腔隙,將一備用的瘤塊植入其中,明膠海綿封閉肝臟切口,將肝臟回納腹腔,4號絲線逐層縫合腹壁切口各層,關(guān)閉腹腔。待實驗兔復(fù)蘇后,送回動物中心飼養(yǎng)。術(shù)后肌肉注射青霉素及慶大霉素(青霉素 40000U/kg,慶大霉素2000U/kg),每天 1次,共 3天,以預(yù)防感染。

1.5 影像檢查:接種后采用 CT掃描監(jiān)測兔 VX2腫瘤生長情況。CT掃描包括上腹部平掃及增強雙期(動脈期及門靜脈期)掃描。于接種 VX 2腫瘤后2-3周,對實驗兔進(jìn)行 DSA。插管方法:切開股動脈,采用 3FSP微導(dǎo)管(日本 Terumo)進(jìn)行腹腔動脈和肝動脈插管。造影后采用碘化油進(jìn)行肝動脈栓塞。

1.6 病理學(xué)檢查:實驗完成后處死實驗兔,進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理:采用 SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié) 果

本組 26例,觀察期間荷瘤兔生長正常,無感染及其他并發(fā)癥,接種成功率 100%。腫瘤平均直徑約 8.0 mm。在 CT平掃,瘤灶呈低密度,在肝動脈期,瘤灶表現(xiàn)為不同程度的環(huán)形強化,在門脈期,瘤灶呈低密度,與周圍肝組織分界清楚。DSA可見腫瘤染色。肝動脈栓塞后見病灶內(nèi)碘化油沉積較明顯。病理學(xué)檢查:腫瘤呈結(jié)節(jié)狀,突出于肝表面,表面較光滑,質(zhì)硬,切面呈灰白色,部分瘤灶中心有灰黃色凝固性壞死,瘤灶與周圍正常肝組織分界清楚,部分可見包膜。光鏡下,腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布,細(xì)胞較大,形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂,血竇多,胞核大而深染,胞質(zhì)量少,腫瘤組織與周圍肝組織界限清楚(圖1-10)。

3 討 論

兔 VX2肝癌接種方法較多,主要有細(xì)胞懸液經(jīng)皮穿刺肝實質(zhì)注射種植法,經(jīng)腸系膜上動脈或門靜脈注射法,經(jīng)肝動脈注射法,開腹直視下注射接種法和瘤塊包埋法等[2-4]。種植方法不同,其成功率及其表現(xiàn)亦不盡相同,其中以開腹瘤塊包埋法種植成功率較高。由于兔肝左葉體積明顯大于右葉,肝左動脈較粗大,肝右動脈較細(xì)小,膽囊動脈又多來源于肝右動脈,為便于操作,以及在行肝動脈栓塞時避免栓塞材料進(jìn)入膽囊動脈,常將瘤組織種植在肝左葉。本實驗采用剖腹瘤塊包埋法接種兔 VX2肝癌,瘤塊多種植于肝左葉;瘤塊植入后以明膠海綿塊封閉肝切口,既避免了瘤塊逆出致腹腔種植,又具有滿意的止血效果;術(shù)中嚴(yán)格無菌操作,術(shù)后予以抗感染治療,實驗動物均無感染和出血,接種成功率 100%。

采用 CT掃描監(jiān)測兔 VX2肝癌生長情況,無需開腹或處死實驗動物,病灶顯示清晰。本組兔 VX2肝癌在 CT平掃呈低密度,在動脈期呈不同程度環(huán)形強化,在門靜脈期呈較低密度[5]。在 CT圖像上,兔 VX2肝癌病灶與周圍肝組織分界清楚,與病理檢查結(jié)果一致。

關(guān)于兔 VX2肝癌的血供,文獻(xiàn)中尚有爭議。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為兔 VX2肝癌為富血供腫瘤[1,5-7]。Burgener等[1]對 VX2肝癌進(jìn)行血管造影檢查,發(fā)現(xiàn)VX2肝癌血供豐富。本組兔 VX2肝癌 DSA亦顯示出腫瘤染色。但也有作者認(rèn)兔 VX2肝癌血供并不豐富[8,9]。

目前,應(yīng)用 CT灌注成像研究腫瘤血供已經(jīng)成為影像學(xué)的熱點[10-14],但關(guān)于動物肝臟 CT灌注成像(CT perfusion imaging,CTPI)的研究報道卻較少。文獻(xiàn)中關(guān)于正常兔肝血流灌注的研究所測得兔肝血流灌注值的差異也較大[15-18],可能與各研究者所用方法和條件不同有關(guān)。Zhang等[19]對移植于兔大腿的 VX2瘤進(jìn)行 CT灌注成像研究,結(jié)果顯示 VX2瘤的血流量(blood flow,BF)、血容量(blood volume,BV)和表面通透性(permeability surface,PS)均高于正常肌肉組織,而平均通過時間(mean transit time,MTT)低于正常肌肉組織。Kapanen等[20]采用 CT灌注成像研究 5只新西蘭大白兔 VX 2肝癌,發(fā)現(xiàn)兔VX2肝癌的動脈灌注量顯著高于正常肝臟的動脈灌注量,而門靜脈灌注量顯著低于正常肝臟的門靜脈灌注量。楊林等[21]采用 CT灌注成像技術(shù)對比研究 10例兔 VX2肝癌和 8例正常兔(對照組)血流灌注差異,發(fā)現(xiàn)兔 VX2肝癌肝動脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)和肝動脈灌注指數(shù)(hepatic arterial perfusion index,HAPI)高于對照組;門靜脈灌注量(hepatic portal perfusion,HPP)、總肝灌注量(total liver perfusion,TLP)和門靜脈灌注指數(shù)(hepatic portal perfuiosn index,HPPI)低于對照組。以上研究表明兔 VX2肝癌是主要由肝動脈供血的富血供腫瘤,與人類 PHC血流動力學(xué)特點相似,是PHC介入治療實驗研究的理想動物模型。

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