同工酶技術(shù)在瓜類蔬菜上的應用研究

孟祥波 張鳳麗

（遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)科學院 121000） （《應用生態(tài)學報》編輯部）

同工酶主要指來源相同、催化性質(zhì)相同而分子結(jié)構(gòu)有差異的酶蛋白分子。近年來，同工酶技術(shù)在蔬菜上應用研究已相當廣泛，已成為蔬菜研究不可缺少的一個手段。迄今，在蔬菜上已研究過的同工酶有過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、酸性磷酸酶（APS）、磷酸酯酶、α-淀粉酶、胞外漆酶（ECI）、超氧化物歧化酶（SOD）、兒茶酚酶（Cat）、醇脫氫酶（ADH）等。

1 同工酶技術(shù)在瓜類蔬菜上的研究現(xiàn)狀

同工酶技術(shù)作為一種常規(guī)的分析手段，已廣泛應用于蔬菜的起源、分類、親緣關(guān)系鑒定、遺傳育種、病理和生理等研究領(lǐng)域，極大地推動了蔬菜園藝學科的發(fā)展。在瓜類蔬菜研究中，同工酶技術(shù)的應用極其廣泛。

1.1 瓜類種子純度鑒定

由于雜種同工酶譜帶包含有雙親的譜帶及等位基因間的雜交帶，利用同工酶技術(shù)判斷雜交種子的純度既快速又準確，克服了傳統(tǒng)瓜類種子純度鑒定方法時間長、繁瑣的弊端。從20世紀70年代，人們開始嘗試利用電泳技術(shù)通過分析同工酶譜帶差異鑒定品種純度。紀穎彪等利用同工酶和田間形態(tài)檢測黃瓜F1代的純度，其結(jié)果非常接近，兩者相關(guān)系數(shù)達0.95。曹宛紅等對西瓜品種及種間進行了同工酶及可溶性蛋白差異分析，結(jié)果是某些野生品種和栽培品種間的鑒定可使用同工酶分析，但如京欣 1號父母本親緣關(guān)系很近的雜交種的純度無法鑒定。

1.2 瓜類種質(zhì)資源及親緣關(guān)系鑒定

同工酶技術(shù)已廣泛應用于植物系統(tǒng)學研究植物間的親緣關(guān)系。同工酶是基因表達的產(chǎn)物，遺傳物質(zhì)不同，同工酶譜帶及酶活性有差異。利用同工酶技術(shù)從分子學水平揭示了瓜類種質(zhì)資源的遺傳背景，為豐富和搜集瓜類種質(zhì)資源、瓜類品種選育提供依據(jù)和方法。漆小泉等通過分析南瓜過氧化物酶和酯酶同工酶，認為印度南瓜、美洲南瓜與中國南瓜的親緣關(guān)系較近，而印度南瓜與美洲南瓜之間的親緣關(guān)系較遠，這與利用細胞學研究的結(jié)論相吻合。仇志軍等對32個國內(nèi)外西瓜品種的親緣關(guān)系進行了同工酶分析，親緣關(guān)系越遠，酶帶差異越大；野生品種由于基因庫豐富，酶帶數(shù)目多于栽培品種；還將28個品種分為8類，與實際的品種親緣關(guān)系相符。目前，對黃瓜的分類、鑒別、起源關(guān)系的研究等方面都已應用了同工酶技術(shù)。

區(qū)炳慶等采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，分析研究了美洲南瓜和中國南瓜共10個不同栽培品種的過氧化物酶 （POD）及多酚氧化酶（PPO）同工酶，結(jié)果表明：POD同工酶分離出10條酶帶，酶譜較復雜；PPO同工酶共分離出6條酶帶，酶譜簡單，分離清晰。因此PPO同工酶技術(shù)在南瓜品種親緣關(guān)系鑒定方面具有準確、直觀、明了等優(yōu)點，尤其對于美洲南瓜效果較好，認為 PPO同工酶可作為鑒定美洲南瓜品種間親緣關(guān)系的一個指標。黃秀麗等利用PAGE對南瓜屬不同種及品種間4種蛋白組分的電泳譜帶進行了比較，發(fā)現(xiàn)不同種間水溶蛋白和鹽溶蛋白譜帶差異較大，且各栽培種都有特征蛋白條帶。不同栽培種間酸溶蛋白譜帶的差異較小，因此可用水溶蛋白和鹽溶蛋白電泳譜帶區(qū)分不同栽培種。分析蛋白譜帶可知美洲南瓜與中國南瓜親緣關(guān)系較近，與印度南瓜則較遠，這與漆小泉等的實驗結(jié)果一致。由此可見，種子蛋白PAGE可用于分析南瓜屬不同種之間的親緣關(guān)系。

1.3 雜種優(yōu)勢預測

雜種優(yōu)勢與同工酶酶譜類型有關(guān)，具雜種酶譜或互補酶譜的組合常屬強優(yōu)勢組合；具單一親本酶譜的組合，不同作物優(yōu)勢表現(xiàn)不同；而無差異型酶譜的組合，一般為無優(yōu)勢或弱優(yōu)勢組合。預先分析親本酶譜，在一定程度上可減少育種工作的盲目性，有利于育種工作者較快捷地選配出高優(yōu)組合。Schwartz（1960）是最早利用同工酶預測雜種優(yōu)勢的。張興平等報道了西瓜雜種POD同工酶表現(xiàn)“偏父型”酶譜的大多在產(chǎn)量和抗性方面表現(xiàn)較強的雜種優(yōu)勢，雜種缺少雙親某些酶帶的均表現(xiàn)為雜種負勢或優(yōu)勢不明顯。

1.4 瓜類抗性鑒定

植物在溫度不適宜條件下或病原菌侵入體內(nèi)后生理代謝會發(fā)生變化，引起體內(nèi)多種同工酶系統(tǒng)活性的改變，因此可通過同工酶的變化來判斷抗性大小，為進一步篩選抗性強類型提供依據(jù)。近年來，同工酶在瓜類作物抗性方面的研究主要在抗病性、抗寒性上?？共》矫婕性诳箍菸『涂共《镜难芯?。王瑜將黃瓜接種病原菌后，引起體內(nèi)過氧化物酶活性提高以及過氧化物酶同工酶的變異，從中篩選出抗枯萎病的品種和植株。顧衛(wèi)紅等探討了同工酶系統(tǒng)（POD、COT、CYT）與甜瓜枯萎病的關(guān)系。張興平等對感染病毒后的薄皮甜瓜和厚皮甜瓜功能葉片同工酶進行分析表明，POD和CAT酶帶數(shù)目增多，出現(xiàn)了新的譜帶，尤其CAT同工酶，病株出現(xiàn)了健株中未曾發(fā)現(xiàn)的CAT2譜帶。劉鴻先將不同耐寒力黃瓜幼苗的子葉置于低溫條件下，研究了各細胞器中SOD同工酶的變化，發(fā)現(xiàn)同工酶易受外界條件影響而發(fā)生變化，說明通過分析同工酶可初步判斷其對低溫的抗性大小。

1.5 檢測瓜類多倍體

同工酶酶譜特殊帶的增減變化或新譜帶的出現(xiàn)，在一定程度上可反映出與染色體數(shù)目、變位等有關(guān)的遺傳變異情況。陳清華等曾用過氧化物酶和酯酶同工酶鑒定二倍體 （2X）、三倍體（3X）、四倍體（4X）西瓜，結(jié)果表明，四倍體西瓜的酯酶活性比二倍體低；而無籽西瓜組合母本的譜帶與F1差異較明顯。馬德偉也認為甜瓜四倍體過氧化物同工酶的活性低于二倍體。再次證實了在其他作物研究中隨染色體倍性的增加，同工酶活性降低的結(jié)論，可以利用這個特點鑒定瓜類多倍體。

1.6 生長發(fā)育狀況的估測

在大白菜、甜瓜、茄子、草菇、香菇、甘藍等多種蔬菜上的大量研究已證實，同工酶具有階段特異性和組織特異性。朱立武等發(fā)現(xiàn)西瓜種子未萌發(fā)、萌發(fā)時、子葉期和真葉期POD酶帶數(shù)目不同、酶活性有差異。南瓜的休眠種子、萌發(fā)2d、4d、5d的幼苗子葉中谷氨酸脫氫酶的同工酶數(shù)目有較大差異，因此，根據(jù)蔬菜同工酶數(shù)目及活性的變化，可初步估測生長發(fā)育的趨勢。

1.7 性別分化的鑒定

同工酶是基因表達的產(chǎn)物，基因調(diào)控植物的性別，同工酶變化先于性別的表現(xiàn)，因此分析同工酶差異就可初步鑒定性別，進而采取相應措施控制性別分化，這將對蔬菜栽培和育種工作產(chǎn)生較大影響，尤其在瓜類、雌雄異株的蔬菜作物上顯得尤為重要。菠菜、石刁柏和瓜類蔬菜已有了應用同工酶控制性別分化的研究。

1.8 基因圖譜的建立和基因連鎖的標記

同工酶作為生化和遺傳標記已被廣泛應用，具有不受環(huán)境修飾，不具有上位干擾和多效應等優(yōu)點，因此在基因連鎖研究和基因圖譜的建立中可被用作遺傳標記。Knerr通過對黃瓜F2群體和回交群體的同工酶研究，構(gòu)建了具有12個同工酶位點的連鎖圖，圖譜總長266cM，包括4個連鎖組。Meglic等利用同工酶和形態(tài)抗病標記位點一張多種標記的連鎖圖，包括4個連鎖組。

2 存在問題及應用前景

同工酶技術(shù)已應用在瓜類作物許多方面。但我們在采用這項技術(shù)時，應注意同工酶的一些特殊性——具有階段特異性和組織特異性。為保證實驗結(jié)果具有可比性、代表性，首先應找出同工酶相對穩(wěn)定時期和相對穩(wěn)定部位進行取樣。如朱立武等發(fā)現(xiàn)西瓜休眠種子有3條弱的POD酶帶，種子萌發(fā)時酶帶迅速增至6條，但活性仍較弱，子葉期和真葉期酶帶和活性較前一階段明顯增強。南瓜的休眠種子中只有一種谷氨酸脫氫酶的同工酶，萌發(fā)2d的幼苗子葉內(nèi)又形成此酶的2種同工酶，經(jīng)4d同工酶增至5種，而經(jīng)5d后則為7種。因此，在確定某同工酶酶帶是否是雜種帶和特征帶時，應在不同時期不同部位反復驗證，才能得出最為確切的結(jié)論。

為使同工酶技術(shù)在瓜類作物研究中發(fā)揮出更經(jīng)濟、便捷、快速、準確的特點，進一步深入研究建立同工酶技術(shù)測定方法的標準化體系，是我們應該重視解決的問題，以拓寬同工酶在各種作物的應用空間。