低溫植酸酶產(chǎn)生菌鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)初步研究

陳 璨，遲乃玉，王 鑫，董 碩，張慶芳*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連，116034；2.大連大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；3.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)中心，遼寧 大連 116622）

植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸 （或磷酸鹽）和肌醇的一類酶[1]。其來源廣泛，在微生物、動物、植物中都有發(fā)現(xiàn)[2]。由于植酸酶可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，已經(jīng)成為食品、酶制劑及飼料添加劑研究的熱點(diǎn)[3]?，F(xiàn)在應(yīng)用的植酸酶大多是中溫和高溫酶，最適酶溫度一般為44℃～60℃[4]，在較低溫環(huán)境中效果達(dá)不到最佳。而低溫植酸酶表現(xiàn)出在較低溫條件下（0℃～30℃）催化活力高、酶的最適作用溫度低等特征。特別是在當(dāng)今世界資源及能源危機(jī)的情況下，低溫植酸酶可以有效的利用有機(jī)磷（植酸及植酸鹽），降低能耗，節(jié)約能源。目前，國內(nèi)外對產(chǎn)低溫植酸酶菌株的研究較少。本研究分離出一株產(chǎn)低溫植酸酶的菌株，進(jìn)行了初步鑒定；并初步研究了其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌株

酵母菌CZC0208：分離于渤海灣，保藏于大連大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：植酸鈣0.10%、葡萄糖5.00%、NH4NO30.40%、KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、瓊脂1.50%、蒸餾水100mL、pH5.5。

保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[5]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.00%、蛋白胨1.00%、硫酸銨0.30%、KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、蒸餾水100mL、pH5.5。

1.3 菌株分離

將樣品按一定比例稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基上，在15℃培養(yǎng)3d～5d，保藏產(chǎn)生透明圈的菌株。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)分析

觀察菌落形態(tài)、顏色、直徑以及用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)等，進(jìn)行分析[6]。

1.4.2 ITS序列分析

利用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品的基因組DNA，ITS 區(qū)段的擴(kuò)增采用引物1（ITS1：5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和引物2（ITS4：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）。PCR反應(yīng)體系（50μL）：模板1μL，引物1 1.0μL，引物2 1.0μL，dNTP S 1μL，Pfu Buffer 5.0μL，Pfu 酶0.25μL，補(bǔ)加雙蒸水到50μL。擴(kuò)增程序?yàn)?8℃雙鏈預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃復(fù)性25s，72℃延伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸4min。以CZC0208DNA為模板，利用ITS rDNA通用引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收。PCR回收產(chǎn)物由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。將測得的ITS區(qū)rDNA基因核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行blast比對，獲取與CZC0208 ITSrDNA基因序列相似度高的菌種。采用Clustal X進(jìn)行多序列匹配比對，通過Mega4.1軟件計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育樹評估采用自舉法（Bootstraping），自舉次數(shù)設(shè)置為1000次。

1.5 酶活力測定

酶活測定方法[7]：植酸酶活力定義為每分鐘水解1nmol無機(jī)磷所需的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。

1.6 溫度對酶活的影響測定

按照植酸酶的測定方法，在不同溫度，分別測定其降解植酸鈉的能力，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

利用分離培養(yǎng)基從采自渤海灣的樣品中篩選出3株能夠產(chǎn)生低溫植酸酶的酵母菌，其中一株命名為CZC0208，挑取CZC0208少許點(diǎn)種于分離培養(yǎng)基上，在15℃培養(yǎng)3d～5d后得到單菌落，有較明顯透明圈。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

植酸酶產(chǎn)生菌菌落特征和菌體形態(tài)見附表。

附表 菌落特征和菌體形態(tài)Attached table.Colony characteristics and cellular morphology

挑取少許分離純化后的菌體，進(jìn)行美蘭染色，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株形態(tài)Figure 1.Morphology of strain CZC0208

根據(jù)菌落及細(xì)胞形態(tài)，初步鑒定該菌株為酵母菌。

2.2.2 菌株ITS rDNA的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

該菌株ITS rDNA經(jīng)測序其長度為372bp。

從GenBank中下載與CZC0208的ITS相似性高的菌株的ITS序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖2。

由圖2系統(tǒng)發(fā)育樹表明，CZC0208與Dipodascussp.Ccre7（AF481862.1）在同一分支上，同源性為99%。與CNY0820系統(tǒng)發(fā)育比較密切的菌株還有：Galactomyces geotrichum（DQ189222.1）、Geotrichumsp.Po67（AY513953.1）、Geotrichumsp.Po4-mu（AY211069.1）、Dipodascaceaesp.LM380（EF060694.1）、Galactomycesgeotrichum（AJ279445.1）、Dipodascus australiensis（AF157596.1）。因?yàn)榫闏ZC0208與Dipodascussp.Ccre7同源性最高，達(dá)到99%，所以初步鑒定為Dipodascus（雙足囊菌屬）。CZC0208的ITSrDNA序列：

圖2 鄰接法構(gòu)建的菌株CZC0208的ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2.Phylogenetic tree based on ITS rDNA gene sequences of CZC0208

2.3 低溫植酸酶的最適溫度

在不同溫度條件下，分別測定粗酶液降解植酸鈉的能力，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，15℃～35℃時植酸酶活力逐步上升，當(dāng)溫度為35℃時，酶的活力達(dá)到最高點(diǎn)，酶活為90.17U/mL。隨著溫度升高，酶活力又逐步下降。表明在20℃～30℃時，有一定的催化活力，其最適溫度為35℃。

3 小結(jié)與討論

圖3 溫度對低溫植酸酶的影響Figure 3.Effect of temperature on activity of phytase

從渤海灣分離出一株產(chǎn)低溫植酸酶的菌株，命名為CZC0208，由菌落特征和菌體形態(tài)以及ITS rDNA的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果可初步鑒定菌株CZC0208為酵母菌，屬于雙足囊菌屬（Dipodascus）。該菌所產(chǎn)植酸酶活力在35℃時達(dá)到最大，較中溫及高溫植酸酶最適作用溫度低。

植酸酶可以催化水解反應(yīng)將磷酸鹽從植酸中釋放出來，提高磷利用率，降低環(huán)境中的磷污染[8]，并可以消除植酸的螯合作用，促進(jìn)動物對礦質(zhì)元素的吸收。此外植酸酶還是一種新型食品添加劑和制備藥用肌醇磷酸酯的催化劑。有關(guān)低溫植酸酶的研究尚處于起步階段，主要集中在菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、相關(guān)基因克隆以及酶學(xué)性質(zhì)的研究等方面[9]。

[1]WODZINSKY R J,ULLAH A H J.Phytase[J].Adv Appl Microbiol,1996,42:263-302.

[2]CAO L,WANG W,YANG C,et al.Application of microbial phytase in fish feed[J].Enzyme Microbiol Tech,2007,40:497-507.

[3]周建琴，劉菊香.聚乙烯醇復(fù)合固定化植酸酶方法研究[J].中國釀造，2009（11）：112-115.

[4]OH BC,CHOI WC,PARK S,et al.Biochemical properties and substrate speci cities of alkaline and histidine acid phytases[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,63:362-372.

[5]陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[6]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[7]葉 冰，王運(yùn)吉，張苓花.植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（3）：193-196.

[8]LUO H Y,HUANG H Q,YANG P L,et al.A Novel Phytase appA from Citrobacter amalonaticus CGMCC1696:Gene Cloning and Overexpression in Pichia pastoris[J].Curr Microbiol,2007,55:185-192.

[9]HUANG H,LUO H,WANG Y,et al.Novel Low-Temperature-Active Phytase from Erwinia carotovora var.carotovota ACCC 10276 [J].J Microbiol Biotechnol,2009,19(10):1085-1091.