復(fù)方中草藥對(duì)鏡鯉（Cyprinus carpio L.）血清轉(zhuǎn)氨酶及紅細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

孟兆娜，陳玉春，管雪婷，張 輝，劉 敏*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的不斷提高，大量化學(xué)及抗生素類(lèi)藥物被長(zhǎng)期使用，不但造成環(huán)境和水質(zhì)污染，而且致使病原體的抗藥性和水產(chǎn)品的藥殘、藥害等毒副作用日益增強(qiáng)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。中草藥具有成本低、加工方便、抗藥性小且藥物殘留少、效果顯著等特點(diǎn)，已逐步成為水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑研究的熱點(diǎn)[1]。其中，部分中草藥成分已作為免疫增強(qiáng)劑得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)還是良好的抗菌、抗病毒的治療藥物[2]。研究表明，中草藥可以有效提高淡水蝦、中國(guó)對(duì)蝦、異育銀鯽和牙鲆的免疫力[3－7]。蔡中華等研究報(bào)道，黃連、大黃及花粉對(duì)鯉魚(yú)的非特異性免疫功能具有增強(qiáng)作用[8]。陳玉春等研究了中草藥作為飼料添加劑對(duì)鯉魚(yú)血清轉(zhuǎn)氨酶的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)鯉血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性有一定的降低誘導(dǎo)作用[9]。蔡春芳等研究發(fā)現(xiàn)，大蒜、螺旋藻、刺五加、黃芪能夠顯著促進(jìn)銀鯽血清中溶菌酶、超氧化物岐化酶的活性[10]。

目前，復(fù)方中草藥作為免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)鏡鯉免疫學(xué)的研究在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)金銀花、刺五加、枸杞子、黃芪配伍的四組復(fù)方中草藥研究對(duì)鏡鯉血清轉(zhuǎn)氨酶及紅細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶、超氧化物岐化酶活性的影響，為復(fù)方中草藥作為魚(yú)類(lèi)免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用研究提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

金銀花、刺五加、枸杞子、黃芪（均購(gòu)自哈爾濱市寶豐藥店），經(jīng)烘干、粉碎后按一定比例進(jìn)行組方，制成四種復(fù)方（復(fù)方Ⅰ、復(fù)方Ⅱ、復(fù)方Ⅲ、復(fù)方Ⅳ）。基礎(chǔ)日糧以國(guó)產(chǎn)魚(yú)粉17%、豆粕47%、麩皮23%、面粉10%、食鹽0.6%、磷酸二氫鈣1.2%、預(yù)混料1.2%為原料進(jìn)行配制。每復(fù)方稱(chēng)取原料20 g，置于砂鍋中并加入200 mL蒸餾水，煎煮3次，每次30 min，合并3次濾液添加到1 kg的基礎(chǔ)日糧中并混勻，制成含2%復(fù)方水提液的藥物飼料結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方中草藥配方比例Table 1 Formula proportional of Chinese herb compounds (%)

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用鏡鯉（Cyprinus carpio L.）購(gòu)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實(shí)驗(yàn)站。試驗(yàn)前，投喂不含中藥添加劑的飼料（基礎(chǔ)日糧）對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行馴化，使其逐漸適應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料。經(jīng)過(guò)14 d的馴化飼養(yǎng)后，選擇體型均勻、初始體重為（160±15）g的實(shí)驗(yàn)魚(yú)，將實(shí)驗(yàn)魚(yú)分為5個(gè)處理，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18尾，試驗(yàn)周期為42 d。各處理組依次為對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧組）、復(fù)方Ⅰ、復(fù)方Ⅱ、復(fù)方Ⅲ、復(fù)方Ⅳ。實(shí)驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)于室內(nèi)玻璃水族箱（0.9 m×0.5 m×0.5 m），體積為 180 L。以充分曝氣的自來(lái)水作為循環(huán)水源。水溫控制在23±1 ℃，pH 7.6～8.0。溶解氧＞8 mg·L－1。日投喂量為魚(yú)體重的1.5%，早、中、晚各投喂（分別為8:30、12:30、17:00）1次，3 d換水1次，6 d消毒1次。

1.3 樣品收集與測(cè)定

試驗(yàn)過(guò)程中，分別于14、28、42 d從各試驗(yàn)組中隨機(jī)取3尾魚(yú)于尾靜脈取血4.5 mL，將其中0.5 mL血液經(jīng)肝素鈉抗凝備用；剩余4 mL血液靜置 2 h，以 1 000 r·min－1離心 10 min，得到血清樣品，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取50 μL抗凝血加雙蒸水至2.5 mL混勻配成1：49的溶血液，進(jìn)行紅細(xì)胞CAT活性的測(cè)定；取抗凝血 50 μL，加入2 mL生理鹽水，以 2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，去上清并加入冰雙蒸水0.2 mL混勻，隨后加入95%乙醇0.1 mL振蕩30 s，并加入三氯甲烷0.1 mL置旋渦混勻器混勻1 min，以3 500 r·min－1離心8 min，吸取上清液并記錄其體積，進(jìn)行紅細(xì)胞SOD活性的測(cè)定。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定血清中GOT、GPT的活性及紅細(xì)胞中CAT、SOD的活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One－way ANOVA），若有顯著差異，再作LSD多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清GOT、GPT活性的變化

四種復(fù)方中草藥對(duì)鏡鯉血清GOT、GPT活性的影響見(jiàn)表2。

表2 鏡鯉血清GOT、GPT活性（±S）Table 2 GOT and GPT activities in serum of Cyprinus carpio L.(±S)

表2 鏡鯉血清GOT、GPT活性（±S）Table 2 GOT and GPT activities in serum of Cyprinus carpio L.(±S)

注：同列相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05），同列不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著（P＜0.01），未標(biāo)注差異不極顯著。下表同。Notes:values in the same column with the same little letters are no significant difference(P＞0.05),with different little letters are significantly differentce(P＜0.05),values in the same column with different capital letters are extremely significant difference(P＜0.01).The same as below.

時(shí)間（d）Time組別Group谷丙轉(zhuǎn)氨酶（IU·L－1）Glutamic－pyruvic transaminase 24.38±9.20 22.96±5.37 14谷草轉(zhuǎn)氨酶（IU·L－1）Glutamic－oxal(o)acetic transaminase 44.58±8.77 41.55±11.63 37.37±6.5520.46±8.86 40.15±10.19 25.60±7.28 39.63±5.22 23.70±8.20 43.86±12.32b 19.35±4.82b 38.22±8.48ab 18.47±6.41ab 2833.30±5.01a 14.35±2.74ab 37.06±7.21ab 13.54±2.67a 42.64±12.77b 15.63±3.94ab 40.73±11.88 20.62±2.14Bc 37.78±13.31 12.14±5.08Aab 42對(duì)照復(fù)方Ⅰ復(fù)方Ⅱ復(fù)方Ⅲ復(fù)方Ⅳ對(duì)照復(fù)方Ⅰ復(fù)方Ⅱ復(fù)方Ⅲ復(fù)方Ⅳ對(duì)照復(fù)方Ⅰ復(fù)方Ⅱ復(fù)方Ⅲ復(fù)方Ⅳ32.49±4.87 7.62±1.85Aa 36.77±7.73 14.13±9.21Ab 36.80±8.5413.89±6.73Ab

從表2可以看出，14 d時(shí)，血清GOT活性各復(fù)方組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時(shí)，復(fù)方Ⅱ組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），復(fù)方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；42 d時(shí)，各復(fù)方組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。14 d時(shí)，血清GPT活性各復(fù)方組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時(shí)，僅復(fù)方Ⅲ組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），復(fù)方Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；42 d時(shí)，各復(fù)方組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），但各復(fù)方組之間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)周期內(nèi)4個(gè)復(fù)方組均有效地降低了血清中GOT及GPT的活性，且隨中草藥飼喂時(shí)間的增加，GOT及GPT的下降幅度也隨之增加，GPT活性的下降幅度比GOT大，表明4組復(fù)方在該試驗(yàn)周期內(nèi)對(duì)魚(yú)體肝臟起到了一定程度的保護(hù)作用。

2.2 紅細(xì)胞CAT、SOD活性的變化

四種復(fù)方中草藥對(duì)鏡鯉紅細(xì)胞CAT、SOD活性的影響見(jiàn)表3。從表3可以看出，14 d時(shí)，各復(fù)方組紅細(xì)胞CAT活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時(shí)，僅復(fù)方Ⅰ組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），雖然其他復(fù)方組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），但是其紅細(xì)胞CAT活性明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明此期間各復(fù)方誘導(dǎo)CAT活性升高。42 d時(shí)，僅復(fù)方Ⅰ組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），但是各復(fù)方組CAT活性均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。14 d時(shí)，紅細(xì)胞SOD活性各復(fù)方組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時(shí)各復(fù)方組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），各復(fù)方組SOD酶活性均保持在較高水平；42 d時(shí)，各復(fù)方組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），雖然開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，但仍明顯高于對(duì)照組。

表3 鏡鯉紅細(xì)胞CAT、SOD活性（S）Table 3 CAT and SOD activities in erythrocyte of Cyprinus carpio L(±S)

表3 鏡鯉紅細(xì)胞CAT、SOD活性（S）Table 3 CAT and SOD activities in erythrocyte of Cyprinus carpio L(±S)

時(shí)間（d）Time組別Group對(duì)照復(fù)方Ⅰ復(fù)方Ⅱ復(fù)方Ⅲ復(fù)方Ⅳ對(duì)照復(fù)方Ⅰ復(fù)方Ⅱ復(fù)方Ⅲ復(fù)方Ⅳ對(duì)照復(fù)方Ⅰ復(fù)方Ⅱ復(fù)方Ⅲ復(fù)方Ⅳ過(guò)氧化氫酶（U·g－1Hb）Catalase 32.71±4.57 40.10±11.91超氧化物歧化酶（U·g－1Hb）Superoxide dismutase 386.52±102.35 487.96±304.36 1437.18±8.14461.56±119.07 37.28±10.67 497.25±215.42 35.42±8.06 559.41±279.01 33.51±6.65a 528.79±92.27Aa 43.42±10.80b 1 326.41±324.01Bc 2838.52±9.27ab 936.17±227.47Bb 39.90±11.48ab 1 155.20±427.64Bbc 35.63±6.83ab 1 023.45±153.15Bb 30.00±4.70a 335.12±160.86 39.58±7.23b 514.46±207.46 4233.17±11.28ab 436.33±168.33 35.37±6.72ab 410.19±171.59 32.82±9.51ab 373.10±304.68

3 討論與結(jié)論

3.1 復(fù)方中草藥對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

GPT和GOT是廣泛存在于動(dòng)物線粒體中的重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起重要作用[11]，其活性變化亦是反映肝細(xì)胞受損傷的主要敏感指標(biāo)。在正常情況下，血清中正常轉(zhuǎn)氨酶活性值較??；當(dāng)組織中毒發(fā)生病變或者受損傷的組織范圍較大，可引起血清中GPT和GOT濃度上升或活性突然持續(xù)性增強(qiáng)[12]。血清轉(zhuǎn)氨酶升高反映肝細(xì)胞受損，其增高程度大致與病變嚴(yán)重程度相平行[13]。因此血清中GOT和GPT活性的增減可以反映機(jī)體中毒或病理變化。陳鵬飛等通過(guò)兩種中草藥組方對(duì)鯽魚(yú)轉(zhuǎn)氨酶影響研究發(fā)現(xiàn)中草藥對(duì)魚(yú)體有保肝的功效[14]，即可以有效地的使血清中的GOT、GPT降低，且隨添加濃度的升高，魚(yú)體血清中GPT和GOT的下降幅度也隨之增大。田海軍、楊加瓊等同樣得出類(lèi)似結(jié)論[15－16]。在本試驗(yàn)中，14 d時(shí)僅復(fù)方Ⅰ肝臟GOT活性與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），其余各復(fù)方組肝臟GOT、GPT活性與對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05）；28 d時(shí)，復(fù)方Ⅱ組血清GOT活性和復(fù)方Ⅲ組血清GPT活性極顯著與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；42 d時(shí)，各復(fù)方組血清GPT活性與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）。隨中草藥飼喂時(shí)間的增加，GOT、GPT活性下降幅度也隨之增大。結(jié)果表明，本試驗(yàn)4組復(fù)方在42 d內(nèi)未對(duì)肝臟造成損傷，還在一定程度上起了保護(hù)作用，其中復(fù)方Ⅰ組轉(zhuǎn)氨酶活性值降低幅度最小。

3.2 復(fù)方中草藥對(duì)紅細(xì)胞CAT活性的影響

過(guò)氧化氫酶（CAT）又稱(chēng)觸酶，是生物體內(nèi)重要的抗氧化防御性功能酶，體內(nèi)SOD清除過(guò)量O2－所產(chǎn)生的過(guò)量H2O2可由CAT與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等一起消除，從而維持機(jī)體正常的機(jī)能[17－18]。CAT酶廣泛存在于魚(yú)體的各個(gè)器官中，是評(píng)價(jià)污染物對(duì)水生生物影響的重要指標(biāo)[19]。大量試驗(yàn)表明，在污染脅迫下生物體可通過(guò)增強(qiáng)CAT清除活性氧的水平以減輕對(duì)機(jī)體的傷害，其活性可因氧化污染的脅迫而發(fā)生改變[20－22]，因此CAT的活力變化在一定程度上能反映出機(jī)體在脅迫環(huán)境下的抗氧化系統(tǒng)的變化。試驗(yàn)表明，14 d時(shí)復(fù)方Ⅰ誘導(dǎo)CAT的活性使其升高，降低了中草藥對(duì)組織細(xì)胞氧化損傷作用，有效的防御組織的過(guò)氧化損傷，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)這種作用表現(xiàn)為降低。28 d時(shí)，雖然僅復(fù)方Ⅰ組紅細(xì)胞CAT活性與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），但其余各復(fù)方也均誘導(dǎo)CAT活性升高；42 d時(shí)，復(fù)方Ⅰ與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），但各組CAT活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。試驗(yàn)初期，機(jī)體為清除過(guò)多的H2O2，通過(guò)自身調(diào)節(jié)而使CAT的合成量升高，但隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體產(chǎn)生了大量的活性氧中間體，超過(guò)了機(jī)體清除活性氧的能力，使大量活性氧中間體作用于酶蛋白分子的關(guān)鍵性氨基酸殘基，使CAT上的－SH巰基氧化成SOS，從而改變CAT酶的結(jié)構(gòu)，使CAT活性降低[23]，對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了不同程度的傷害。由表3可得，復(fù)方Ⅰ組中CAT值升高最明顯，紅細(xì)胞CAT活性受復(fù)方Ⅰ的影響最大。

3.3 復(fù)方中草藥對(duì)紅細(xì)胞SOD活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是反映機(jī)體非特異性免疫功能的重要生理指標(biāo)。它是一種堿性蛋白，能水解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解后被釋放出來(lái)，形成一個(gè)水解酶體系，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物。其活性變化可反映機(jī)體清除自由基的能力，對(duì)于增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能具有重要作用[24]，因而SOD經(jīng)常被用作環(huán)境脅迫與水域污染的潛在指標(biāo)。SOD是清除活性氧免受細(xì)胞氧化傷害的主要抗氧化酶類(lèi)之一，在防御機(jī)體衰老和生物分子損傷等方面有極為重要的作用[18]，它催化超氧陰離子自由基O2－發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除O2－，減少超氧陰離子在生物體內(nèi)的積聚并阻斷其轉(zhuǎn)化為自由基，維持細(xì)胞內(nèi)的氧自由基處于低量無(wú)害狀態(tài)[25－26]。直至1969年McCord和Fridovich研究了該蛋白的活性以后[27]，才根據(jù)其酶活特性定名為超氧化物歧化酶。本試驗(yàn)表明：14 d時(shí)，各復(fù)方組與對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05）；28 d時(shí)，各復(fù)方組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），各復(fù)方組SOD活性均保持在較高水平，雖然在第42天開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，但仍明顯高于對(duì)照組。證明本試驗(yàn)的四個(gè)復(fù)方對(duì)鏡鯉紅細(xì)胞的SOD活性有一定的誘導(dǎo)作用，并且復(fù)方Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ組SOD活性均表現(xiàn)為“先增高再降低”，復(fù)方Ⅱ組的SOD活性隨著作用時(shí)間的增加也逐漸被誘導(dǎo)增高。原因可能是各復(fù)方在處理初期對(duì)紅細(xì)胞SOD活性有誘導(dǎo)作用，這種誘導(dǎo)作用是由活性氧自由基的增加所引起的機(jī)體代償性增多所致。這和樊甄姣報(bào)道的氨氮濃度引起SOD活性暫時(shí)升高相一致。隨著藥物作用的時(shí)間延長(zhǎng)[28]，魚(yú)體內(nèi)O2－對(duì)羥胺的氧化反應(yīng)被抑制，使O2－含量升高，消耗大量的SOD，導(dǎo)致SOD水平的降低。機(jī)體在清除大量自由基的過(guò)程中，ATP生成減少，細(xì)胞內(nèi)能量不足，使SOD合成發(fā)生障礙、活性下降，使機(jī)體清除自由基的能力下降[29]，堆積的自由基一方面可直接作用于細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害，另一方面可致微循環(huán)發(fā)生變化，使細(xì)胞缺血缺氧，產(chǎn)生代謝障礙，進(jìn)一步加劇機(jī)體損害[30]，從而導(dǎo)致魚(yú)體的免疫能力、抗應(yīng)激能力和抗病能力的下降。SOD作為抗氧化劑的作用隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱，從而造成魚(yú)體的過(guò)氧化脅迫，進(jìn)而有產(chǎn)生毒性作用的趨勢(shì)，建議用藥時(shí)間為28 d。

本試驗(yàn)得出，本復(fù)方中草藥可以按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的量加到鏡鯉飼料中，以增強(qiáng)其血清轉(zhuǎn)氨酶及紅細(xì)胞抗氧化酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)其抗病力，其中復(fù)方Ⅰ效果最佳，建議用藥時(shí)間為28 d。

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