巴西蘑菇液體培養(yǎng)及胞外多糖積累研究

鄭樹生，梁麗琨，倪新江

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)測試中心，黑龍江 大慶 163319；2.山東煙臺(tái)大學(xué)生物理工學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murvill）原產(chǎn)于北美南部和南美北部等地，具有濃郁的杏仁香味，含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，特別是促進(jìn)兒童生長發(fā)育和增加智力的精氨酸和賴氨酸，氨基酸總量占干重的21.37%，必須氨基酸占氨基酸總量39.7%，此外還含有多糖、甾類等生理活性物質(zhì)，是一種食藥兼用的珍稀食用菌，其多糖含量位于食用菌之首。巴西蘑菇多糖具有抑制腫瘤、降低血脂、抗癌、抗凝血等功效，可提高肌體免疫力，預(yù)防心腦血管疾病。日本三重大學(xué)醫(yī)學(xué)部岡本丈博士對(duì)巴西蘑菇多糖的抗癌性進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)果表明，巴西蘑菇多糖對(duì)移植到小鼠體內(nèi)的多形細(xì)胞肉瘤細(xì)胞的全治率（生存率）和阻止率是最高的，達(dá)90%，而靈芝最低，僅20%。該結(jié)論得到東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、日本國立癌癥中心研究所、東京藥科大學(xué)證實(shí)[1]。

由于巴西蘑菇的栽培條件要求較苛刻，而且國內(nèi)對(duì)其栽培研究起步較晚，作為商品進(jìn)行生產(chǎn)和銷售的很少，因此價(jià)格較高。研究表明巴西蘑菇液體培養(yǎng)菌絲體的蛋白質(zhì)、多糖等成分的含量與子實(shí)體相當(dāng)，但生產(chǎn)周期卻大大縮短，有利于巴西蘑菇功能食品及抗癌藥物的生產(chǎn)。本試驗(yàn)選用了成本低、來源廣的天然材料作為液體培養(yǎng)基原料，研究了不同培養(yǎng)基中巴西蘑菇菌絲體和胞外多糖的積累，得到了適合巴西蘑菇菌絲生長并積累豐富胞外多糖的液體培養(yǎng)基配方，為更好的開發(fā)和利用巴西蘑菇資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

巴西蘑菇1號(hào)菌種，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、VB 110 mg·100 mL－1。

母種培養(yǎng)基：金針菇菌糠（煮汁）20%、葡萄糖2.0%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.01%、瓊脂2%。

供試碳源：發(fā)酵棉籽殼、馬鈴薯、蔗糖、小麥粉、玉米粉、地瓜粉。

供試氮源：麩皮、黃豆粉、硫酸銨、尿素。供試生長因子：巴西蘑菇菌糠煮汁、酵母粉。有機(jī)天然碳（碳源添加0.1%的α－淀粉酶）、氮源均煮1 h，過濾備用。

1.3 培養(yǎng)方法

取活化菌種3～4塊接種于母種培養(yǎng)基平板上，25～28℃培養(yǎng)3～5 d，無菌打孔器打孔，切取尖端菌絲，用接種鏟將菌種薄片接種于含50 mL液體培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，每瓶3塊，使菌種塊漂浮于液體表面，25～28℃靜止培養(yǎng)48 h，待菌絲萌發(fā)后，25～28 ℃，130 r·min－1，搖床培養(yǎng) 7 d。

1.4 生物量的測定

1.4.1 菌絲球計(jì)數(shù)

將發(fā)酵液倒人培養(yǎng)皿中攤勻，取出菌種塊，培養(yǎng)皿下墊方格紙，方格法計(jì)數(shù)。

1.4.2 菌絲干重測定

溝通了上面的意思，我說：“這樣的問題，你不用解釋，也沒辦法解釋。任何解釋都會(huì)使問題變得更加麻煩。只要你態(tài)度明確毫不含糊地說‘不’，就是對(duì)她對(duì)你最好的負(fù)責(zé)任的表現(xiàn)，相信女孩會(huì)很快地調(diào)整好自己的情緒。當(dāng)然，如果‘是’，就另當(dāng)別論了?！?/p>

紗布過濾得菌絲球，并用蒸餾水洗滌3次，60℃烘至恒重。

1.5 胞外多糖的提取與測定

1.5.1 胞外多糖的提取

發(fā)酵液 4 000 r·min－1離心 15 min，去沉淀，加入3倍體積95%乙醇，0～4℃冰箱醇析24 h，離心棄上清液，95%乙醇洗滌2次，加入10倍體積的蒸餾水，80℃水浴溶解，4 000 r·min－1離心15 min，去沉淀，得多糖上清液。

1.5.2 Sevag法除蛋白

在多糖水溶液中加入等體積的Sevag試劑（正丁醇：四氯化碳=4：1），于125 mL分液漏斗中，振蕩后靜置分層，取下層液體，重復(fù)1～2次，直至上層有機(jī)相澄清為止。

1.5.3 多糖的測定

處理后的多糖溶液，100 mL容量瓶定容，用苯酚硫酸法測定多糖含量[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳液體培養(yǎng)時(shí)間確定

圖1 姬松茸液體培養(yǎng)菌絲體生長曲線Fig.1 Growth curve of mycelium in submerged culture of Agaricus blazei

2.2 不同碳源對(duì)菌絲生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響

分別用葡萄糖、發(fā)酵棉籽殼、蔗糖、玉米粉、小麥粉、地瓜粉、馬鈴薯替代基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的葡萄糖，25～28℃搖床培養(yǎng)7 d，測定生物量和胞外多糖含量，結(jié)果見表1。巴西蘑菇菌絲在不同碳源中的生長速度不同，葡萄糖和玉米粉為碳源時(shí)菌絲生長情況明顯好于其它碳源，玉米粉培養(yǎng)基中產(chǎn)生的小菌絲球（D＜1 mm）占絕大多數(shù)，菌絲球個(gè)數(shù)最多，可達(dá)655個(gè)·50 mL－1，菌絲干重和胞外多糖最高，為 0.952 g·50 mL－1和 72.595 mg·50 mL－1。其次是葡萄糖中產(chǎn)生的總菌絲球個(gè)數(shù)、菌絲干重和胞外多糖含量分別為 578 個(gè)·50 mL－1、0.725 g·50 mL－1和61.328 mg·50 mL－1，說明在這些培養(yǎng)基中接種后萌發(fā)點(diǎn)多，生長速度快，因此葡萄糖和玉米粉均是巴西蘑菇液體培養(yǎng)的優(yōu)良碳源。

2.3 不同氮源對(duì)巴西蘑菇生物量和胞外多糖的影響

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源分別更換為麩皮、黃豆粉、尿素和硫酸銨，搖床培養(yǎng)7 d，測定生物量和胞外多糖，結(jié)果見表2。巴西蘑菇菌絲在以麩皮和硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生物量大，胞外多糖含量高，分別為 0.805 g·50 mL－1、89.933 mg·50 mL－1、0.768 g·50 mL－1和 94.825 mg·50 mL－1，說明硫酸銨和麩皮都是巴西蘑菇液體培養(yǎng)的良好氮源。

表1 不同碳源對(duì)巴西蘑菇生物量和胞外多糖含量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on biomass and exopolysaccharide content of Agaricus blazei

表2 不同氮源和生長因子對(duì)巴西蘑菇生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of different carbon sources and growth factors on biomass and exopolysaccharide content of Agaricus blazei

2.4 不同生長因子對(duì)菌絲生物量和胞外多糖含量的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10%的巴西蘑菇菌糠汁和0.5%的酵母粉，搖床培養(yǎng)7 d，測定生物量和胞外多糖，結(jié)果見表2。巴西蘑菇菌絲體在添加巴西蘑菇菌糠汁的培養(yǎng)基中生長狀況明顯好于對(duì)照，表現(xiàn)在生物量明顯增加，胞外多糖含量顯著提高，生物量和胞外多糖分別達(dá)1.007 g·50 mL－1和127.734 mg·50 mL－1，可見栽培過巴西蘑菇的菌糠廢料是其液體培養(yǎng)時(shí)優(yōu)良的生長促進(jìn)劑，而酵母粉對(duì)菌絲液體培養(yǎng)沒有明顯促進(jìn)作用。

2.5 培養(yǎng)基綜合試驗(yàn)

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和報(bào)道，姬松茸液體培養(yǎng)中采用復(fù)合培養(yǎng)基菌絲體生長狀況好于簡單培養(yǎng)基，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，選用2%玉米粉和2%葡萄糖作碳源，以1%麩皮和1%硫酸銨作氮源，添加10%的巴西蘑菇菌糠汁，設(shè)計(jì)綜合培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)7 d，測定生物量和胞外多糖，結(jié)果見表2。綜合培養(yǎng)基的生物量顯著增加，直徑＜1 mm的菌絲球占絕大多數(shù)，總數(shù)達(dá)1 498個(gè)·50 mL－1，菌絲體干重1.226 g·50 mL－1，胞外多糖積累量 189.428 mg·50 mL－1，證實(shí)復(fù)合碳、氮源更有利于姬松茸菌絲體生長和胞外多糖積累。

2.6 正交試驗(yàn)篩選最佳培養(yǎng)基配方

選擇玉米粉＋葡萄糖/麩皮＋硫酸銨、巴西蘑菇菌糠汁及KH2PO4＋MgSO4·7H2O四因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)（培養(yǎng)基中均含VB110 mg·50 mL－1），因素水平表見表3。正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。各因素的最優(yōu)水平組合是A3B3C2D1，即玉米粉2%、葡萄糖1%、麩皮2%、硫酸銨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、巴西蘑菇菌糠汁10%。

表3 試驗(yàn)因子水平Table 3 Level of experimental factor (%)

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of orthogonal experiment

對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響因素進(jìn)行直觀分析，A因素極差R值為246.4，明顯大于B、C、D三因素，說明A因素對(duì)胞外多糖產(chǎn)量影響最大，即玉米粉和葡萄糖濃度和配比對(duì)巴西蘑菇胞外多糖產(chǎn)量起主要作用，各因素的主次順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D。

對(duì)正交試驗(yàn)胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。A因素即玉米粉和葡萄糖濃度及配比對(duì)胞外多糖產(chǎn)量有極顯著的影響，而麩皮和硫酸銨濃度及姬松茸菌糠汁對(duì)胞外多糖產(chǎn)生有非常顯著的影響，KH2PO4和MgSO4·7H2O則影響不顯著。

表5 正交試驗(yàn)胞外多糖產(chǎn)量方差分析結(jié)果Table 5 Result of exopolysaccharide output variance analysis in orthogonal experiment

3 討論與結(jié)論

3.1 巴西蘑菇液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基

為適合工業(yè)生產(chǎn)，試驗(yàn)中采用了價(jià)格低、來源廣的有機(jī)碳、氮源作為材料，對(duì)巴西蘑菇液體培養(yǎng)基的配方進(jìn)行篩選，得到巴西蘑菇液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基的配方為玉米粉2%、葡萄糖1%、麩皮2%、硫酸銨 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、巴西蘑菇菌糠汁10%。玉米粉和葡萄糖、麩皮和硫酸銨分別是巴西蘑菇液體培養(yǎng)的優(yōu)良碳、氮源。玉米粉在食用菌液體培養(yǎng)中的作用在其他報(bào)道中已被證實(shí)[3]，由于玉米粉溶液粘度較大，增加了培養(yǎng)液的粘性拉力，菌絲間易被發(fā)酵液機(jī)械性地拉開，從而使菌絲球小型化。在食用菌液體培養(yǎng)液中一般認(rèn)為應(yīng)有大量的菌絲球，這樣生長中心多，生物量大，而且菌絲球的大小應(yīng)在1 mm左右，這樣菌絲球內(nèi)部不會(huì)產(chǎn)生氧和營養(yǎng)饑餓的情況，使菌絲生長受到抑制[4]。培養(yǎng)基中添加巴西蘑菇菌糠煮汁不僅明顯促進(jìn)了巴西蘑菇菌絲體生長和胞外多糖積累，而且產(chǎn)生了大量的小菌絲球，可能由于巴西蘑菇菌糠中存在有利于巴西蘑菇菌絲生長的多種營養(yǎng)因子。很多報(bào)道中使用的酵母粉的效果遠(yuǎn)不如巴西蘑菇菌糠煮汁。天然原料如玉米粉、麩皮優(yōu)于葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、尿素等簡單原料，兩種類型的原料配合使用效果更佳。

3.2 巴西蘑菇液體發(fā)酵胞外多糖含量的變化

在巴西蘑菇發(fā)酵液中，有一定含量的胞外多糖，由于真菌的多糖大部分存在于細(xì)胞內(nèi)部，在一定條件下才有一部分分泌到細(xì)胞外。因此，液體培養(yǎng)基中胞外多糖含量與菌絲生物量不成正相關(guān)。培養(yǎng)基加入巴西蘑菇菌糠煮汁，不僅對(duì)菌絲球生長有利而且有利于胞外多糖的分泌，但菌糠汁中有巴西蘑菇菌絲體的胞內(nèi)多糖，因此，在測定發(fā)酵液中胞外多糖時(shí)需減去50 mL 10%的巴西蘑菇菌糠煮汁所含的多糖量。

3.3 巴西蘑菇菌糠對(duì)菌絲體生長的促進(jìn)作用

栽培食用菌后的菌糠的應(yīng)用價(jià)值值得重視，倪新江等認(rèn)為食用菌栽培結(jié)束后，菌糠中的含氮量大幅度升高[5]。不同的食用菌菌糠在其他的食用菌栽培中往往有重要的利用價(jià)值。本試驗(yàn)證實(shí)了巴西蘑菇菌糠對(duì)這種食用菌液體培養(yǎng)菌絲體生長的促進(jìn)作用，在巴西蘑菇母種培養(yǎng)基中使用的金針菇菌糠對(duì)菌絲體生長也有促進(jìn)作用。

3.4 巴西蘑菇液體發(fā)酵菌絲體生長的變化

據(jù)報(bào)道食用菌液體培養(yǎng)需先靜止培養(yǎng)1～2 d[6-8]，試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，如果不靜止培養(yǎng)，則巴西蘑菇菌絲體在液體培養(yǎng)基中萌發(fā)較慢。在接種時(shí)應(yīng)注意使接種塊的菌絲面向上，漂浮于液體的表面，待菌絲體萌發(fā)后再上搖床。在靜止培養(yǎng)時(shí)，添加巴西蘑菇菌糠的培養(yǎng)基菌種塊萌發(fā)較快，菌絲濃密，經(jīng)過48 h，菌絲可長達(dá)3 mm，而其他培養(yǎng)基的菌絲一般短而疏[9-10]。

食用菌的深層發(fā)酵技術(shù)越來越受到人們的重視，因?yàn)樵谝后w深層培養(yǎng)過程中，菌絲細(xì)胞能在最適的溫度、pH、氧氣和C/N等條件下生長，呼吸作用產(chǎn)生的代謝廢氣能及時(shí)排出，新陳代謝旺盛，菌絲生長迅速，在短期內(nèi)就能獲得大量的菌絲體，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的要求。發(fā)酵液經(jīng)醇析去蛋白可得到胞外多糖，用菌絲體代替子實(shí)體可制備菌絲體多糖，這不僅在醫(yī)藥、保健工業(yè)中有很高的應(yīng)用價(jià)值，而且在食品、飼料等工業(yè)上也有廣闊的前景。

[1] 陳智毅,李清兵,吳娛明,等.巴西蘑菇的食療價(jià)值[J].中國食用菌,2001,20(4):4-6.

[2] 張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1987.

[3] 楊梅,林琳,張其昌.姬松茸菌絲深層培養(yǎng)及氨基酸分析研究[J].中國食用菌,1997,16(3):41-43.

[4] 張甫安,陳國榮,李偉芳,等.菌菇深層發(fā)酵和液體菌種生產(chǎn)[J].中國科學(xué)文化,2001,45(2):66-69.

[5] 倪新江,梁麗琨,丁立孝,等.姬松茸在兩種培養(yǎng)基上生長期間九種胞外酶活性變化[J].菌物系統(tǒng),2001,20(4):526.

[6] 凌建亞,李灝,張長鎧.濃香乳菇深層發(fā)酵工藝的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26(4):3-5.

[7] 李瀅冰,馮夢(mèng)醒,徐繼祖.海藻糖在灰樹花深層發(fā)酵中的積累及多糖的提取[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26(2):11-15.

[8]楊淑云.巴西蘑菇液體發(fā)酵菌絲體與子實(shí)體蛋白質(zhì)的營養(yǎng)評(píng)價(jià)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,24(1):82-84.

[9] 殷蓓蓓,周曉燕,李爽.姬松茸的研究與進(jìn)展[J].工業(yè)微生物,2007,37(2):52-56.

[10]張碩,李明,李守勉,等.猴頭菌菌絲體與子實(shí)體多糖產(chǎn)量相關(guān)性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(15):6946-6947.