生物制氫技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景

任南琪，郭婉茜，劉冰峰

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090，rnq@hit.edu.cn)

目前，化石能源短缺，石油價格日益攀升，亟需尋求可再生、高效、清潔能源來替代.氫氣作為清潔能源的首選，是未來理想的燃料之一.在不同的制氫方法中，生物制氫技術(shù)作為一種低成本、低能耗的綠色能源生產(chǎn)技術(shù)，可以結(jié)合有機(jī)廢水處理和清潔能源生產(chǎn)而備受關(guān)注.

本文對生物制氫技術(shù)的發(fā)展及現(xiàn)狀進(jìn)行了分析，指出目前生物制氫領(lǐng)域存在的主要問題，并對生物制氫的前景進(jìn)行了展望.研究結(jié)果對于促進(jìn)生物制氫技術(shù)的發(fā)展和加快生物制氫技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化步伐具有重要的意義.

微生物制氫過程可以分為:(1)暗發(fā)酵制氫; (2)光生物制氫(光解水制氫和光發(fā)酵制氫); (3)光暗發(fā)酵耦合制氫.光解水和光發(fā)酵生物制氫是依賴光能供應(yīng)的過程，暗發(fā)酵生物制氫是不需要光能的過程.這幾種制氫過程主要涉及3種微生物類群:暗發(fā)酵細(xì)菌，光解微生物(綠藻和藍(lán)細(xì)菌)和光發(fā)酵細(xì)菌.

1 暗發(fā)酵生物制氫技術(shù)

暗發(fā)酵生物制氫是利用厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌在厭氧條件下將有機(jī)物分解轉(zhuǎn)化為氫氣，此過程不需要光能供應(yīng).能夠進(jìn)行暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物種類繁多，包括一些專性厭氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌及少量好氧細(xì)菌［1］，例如梭菌屬(Clostridium)、類芽孢菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)等.

目前，已知的暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程主要包括甲酸分解產(chǎn)氫、丙酮酸脫羧產(chǎn)氫以及NADH/NAD平衡調(diào)節(jié)產(chǎn)氫3種途徑.以葡萄糖為例，其暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程為:首先，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸、ATP和NADH;然后，丙酮酸被丙酮酸鐵氧化還原蛋白酶氧化成乙酰輔酶A、CO2和還原性鐵氧化還原蛋白(丙酮酸脫羧過程);或者經(jīng)丙酮酸甲酸裂解酶而分解成乙酰輔酶A和甲酸，生成的甲酸再次被氧化為二氧化碳，并使鐵氧化還原蛋白還原(甲酸裂解過程);最后，還原性鐵氧化還原蛋白在氫化酶和質(zhì)子的作用下生成氫氣.在產(chǎn)氫代謝過程中，不同的生態(tài)環(huán)境和不同的生物類群導(dǎo)致代謝的末端產(chǎn)物也不盡相同.根據(jù)末端代謝產(chǎn)物的不同，可以產(chǎn)生不同的發(fā)酵類型.傳統(tǒng)的暗發(fā)酵生物制氫可以分為丁酸型發(fā)酵和丙酸型發(fā)酵［2］.1990年以來，任南琪等通過對糖蜜廢水的連續(xù)流制氫研究，發(fā)現(xiàn)并提出了新的乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑［3－5］.研究表明，當(dāng)末端產(chǎn)物為乙醇時，氫氣產(chǎn)量較高［6］.特別指出的是E.harbinense sp. B49［7］、E.harbinense sp.Y3［8］及E.harbinense sp. lyf3［9］等高效產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌從CSTR反應(yīng)器的活性污泥中成功地陸續(xù)分離，進(jìn)一步證實(shí)末端產(chǎn)物以乙醇和乙酸為主的代謝類型可以得到較高的氫產(chǎn)率和產(chǎn)量.乙醇和乙酸的耦聯(lián)反應(yīng)可保持NAD +/NADH的平衡關(guān)系，從而使乙醇型發(fā)酵得以有序地進(jìn)行并具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性.

1.1 高效產(chǎn)氫新菌種的選育

為了尋求高效產(chǎn)氫微生物，獲得較高的產(chǎn)氫能力，國內(nèi)外研究者們分離純化了大量新菌種，主要是兼性的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、專性厭氧的梭菌科(Clostridiaceae)以及一些高溫菌屬(Thermoanaerobacterium)等.

Kumar等［10］分離得到的陰溝腸桿菌E.cloacae IIT－BT08，靜態(tài)培養(yǎng)時其最大產(chǎn)氫能力為每摩爾己糖2.7 mol.之后又報道了產(chǎn)氣腸桿菌E.aerogens DM11靜態(tài)培養(yǎng)時的最大產(chǎn)氫能力可達(dá)每摩爾己糖2.80 mol［11］.我國研究者在高效產(chǎn)氫暗發(fā)酵細(xì)菌的選育工作中也取得一定的成績.林明［12］從正在運(yùn)行的生物制氫反應(yīng)器的厭氧活性污泥中分離出產(chǎn)氫細(xì)菌B49，其代謝類型為乙醇型，干細(xì)胞產(chǎn)氫能力為25～28 mmol/(g·h).任南琪等［8－9］陸續(xù)又從CSTR反應(yīng)器中分離出高效乙醇型產(chǎn)氫細(xì)菌Ethanoligenens harbinense sp.R3和Ethanoligenens harbinense sp.Y3，在以葡萄糖為底物時，它們的最大產(chǎn)氫能力分別為干細(xì)胞產(chǎn)氫35.74 mmol/(g·h)和每摩爾葡萄糖產(chǎn)氫2.81 mol，產(chǎn)氫能力在國際上現(xiàn)有的高效野生產(chǎn)氫菌株中居于前列.該課題組還從溫泉中分離出一株能有效利用木糖發(fā)酵產(chǎn)氫的高溫菌T.thermosaccharolyticum W16，每摩爾木糖產(chǎn)氫2.19 mol，最大產(chǎn)氫速率為10.7 mmol/(L.h)［13］.

1.2 暗發(fā)酵生物制氫工藝形式

為了滿足高有機(jī)負(fù)荷和高生物量的要求，研究人員對多種新的工藝進(jìn)行了研究.Alzate－Gaviria等［14］研究發(fā)現(xiàn)，利用UASB反應(yīng)器處理城市垃圾和人工混合污水制氫，在pH=5.7±0.2、水力停留時間24 h的條件下，干細(xì)胞產(chǎn)氫量可達(dá)127 mL/(g·d); Chang等［15］采用有效容積為300 mL的固定床反應(yīng)器，以蔗糖為底物，研究了水力停留時間在0.5～ 5.0 h，不同填料對生物產(chǎn)氫的影響.結(jié)果表明:以膨脹土為填料，水力停留時間為2 h時，最大氫氣產(chǎn)率為0.42 L/(L·h);以活性炭為填料，水力停留時間為1 h時，最大氫氣產(chǎn)率為1.32 L/(L·h). Lin等［16］利用硅膠樹脂做載體，以蔗糖為底物，在流化床中進(jìn)行生物制氫研究，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，蔗糖濃度的升高和水力停留時間的降低都有利于產(chǎn)氫的增加.在蔗糖質(zhì)量濃度為40 g/L，水力停留時間為2.2 h時，每摩爾蔗糖最大氫氣產(chǎn)量為(4.98±0.18)mol.Wu等［17］報道了在膨脹床反應(yīng)器運(yùn)行中，當(dāng)水力停留時間為2 h時，臨界流速為0.85 cm/s，獲得的最大產(chǎn)氫速率為每m3反應(yīng)器0.93 m3/h，每摩爾蔗糖最大氫氣產(chǎn)量可達(dá)2.67 mol.

我國暗發(fā)酵生物制氫技術(shù)發(fā)展較快，任南琪教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組對碳水化合物(含糖廢水)為底物以自絮凝的厭氧活性污泥為氫氣生產(chǎn)者的發(fā)酵產(chǎn)氫進(jìn)行了近20年的研究，研制出了CSTR型和EGSB型兩種高效生物制氫反應(yīng)器，并于1999年完成了世界上首例中試研究，每立方米反應(yīng)器每天穩(wěn)定產(chǎn)氫5.7 m3.2005年，又完成了世界上首例“廢水發(fā)酵生物制氫示范工程”，采用的生物制氫裝置(CSTR型)有效容積65 m3，日產(chǎn)氫能力350 m3，成功完成了與氫燃電池耦合發(fā)電的工程示范，日產(chǎn)氫量可用滿足60～80戶使用.

1.3 暗發(fā)酵生物制氫工藝運(yùn)行與調(diào)控

影響生物制氫反應(yīng)器工藝運(yùn)行的因素很多，如溫度、pH、原料(底物)和水力停留時間等等.

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素之一.大部分產(chǎn)氫微生物屬于嗜溫菌，厭氧菌的最適生長溫度在嗜溫菌生長溫度范圍的上限，但不同發(fā)酵產(chǎn)氫微生物的產(chǎn)氫溫度也存在較大的差異.Kumar等［18］證明 Enterobacter cloacae IITBT08在36℃時具有最大的產(chǎn)氫速率.Jung等［19］對Citrobacter sp.Y19的研究表明，其最適的細(xì)胞生長和產(chǎn)氫溫度為30～40℃.從節(jié)能的角度考慮，有研究者進(jìn)行了常溫發(fā)酵產(chǎn)氫的研究，如Lin等［20］采用厭氧恒化器，在溫度15～34℃范圍內(nèi)進(jìn)行了活性污泥的產(chǎn)氫研究，與(35±1)℃條件下的產(chǎn)氫過程相比，常溫條件下(15～25℃)反應(yīng)器的氫氣產(chǎn)量和氫氣體積分?jǐn)?shù)均遠(yuǎn)低于后者，因此尚未看出常溫發(fā)酵制氫的優(yōu)勢.也有少數(shù)報道控制最佳產(chǎn)氫溫度為高溫范圍，如55℃時，可以達(dá)到較好的產(chǎn)氫效能［21］.

pH值對發(fā)酵產(chǎn)氫的影響往往與細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD動態(tài)平衡和產(chǎn)氫菌的生理?xiàng)l件有關(guān). pH值會影響產(chǎn)氫微生物細(xì)胞內(nèi)氫化酶活性和(或)代謝途徑，另外還會影響細(xì)胞的氧化還原電位、基質(zhì)可利用性、代謝產(chǎn)物及其形態(tài)等.多數(shù)文獻(xiàn)報道［22－25］，嚴(yán)格的丁酸梭菌產(chǎn)氫最佳 pH是6.0～6.5;而產(chǎn)氣腸桿菌的產(chǎn)氫最佳pH在5.5～6.0［26］.Monot等［27］研究了細(xì)胞內(nèi)pH值對發(fā)酵產(chǎn)物的影響，結(jié)果表明，高pH值條件下的發(fā)酵產(chǎn)物以酸類物質(zhì)為主，低pH值條件下的發(fā)酵產(chǎn)物往往是丙酮和丁醇等物質(zhì).利用混合細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳pH范圍的報道分歧較大.大部分研究表明［28－33］，厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌產(chǎn)氫的最佳pH范圍在5.5左右.而任南琪等報道的乙醇型發(fā)酵最佳產(chǎn)氫pH 4.2～4.5［34］.

發(fā)酵法生物制氫過程的可持續(xù)性取決于產(chǎn)氫原料(底物)，而整個工藝的效率取決于底物的物理化學(xué)性質(zhì).目前的理論研究通常使用純底物(主要是葡萄糖、蔗糖、淀粉和纖維素)，而生產(chǎn)性應(yīng)用則需要更為復(fù)雜的底物.研究發(fā)現(xiàn)，糖蜜廢水較適于暗發(fā)酵產(chǎn)氫［35］，淀粉產(chǎn)氫也具有較好的應(yīng)用前景［36］.也有少數(shù)報道以有機(jī)廢棄物［37－40］，如豆腐渣、生活垃圾作為厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的底物，這類產(chǎn)氫試驗(yàn)還僅限于小批量的間歇試驗(yàn)階段，另有報道［41－42］以結(jié)晶纖維和麥稈作為發(fā)酵產(chǎn)氫底物，這些研究為降低生物制氫成本做出了極大的貢獻(xiàn).

對于連續(xù)流運(yùn)行的發(fā)酵產(chǎn)氫反應(yīng)器，水力停留時間是重要的調(diào)控因子.從目前的研究看，厭氧反應(yīng)器控制的水力停留時間通常為2～24 h，并且水力停留時間的差異與反應(yīng)器結(jié)構(gòu)形式的差異密切相關(guān).文獻(xiàn)［43］指出:應(yīng)用連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器(CSTR)，最佳產(chǎn)氫的水力停留時間通?？刂圃?～12 h;序批式厭氧反應(yīng)器［44］最佳產(chǎn)氫的水力停留時間通?？刂圃?～12 h;填充式反應(yīng)器［45－46］最佳產(chǎn)氫的水力停留時間通常控制在2～6 h;添加載體的豎向流反應(yīng)器最佳水力停留時間很短，為0.5～2.0 h［47］.EGSB反應(yīng)器在連續(xù)流生物制氫中顯示出很多優(yōu)勢，在反應(yīng)器停留時間為1.5～2.0 h時，每摩爾葡萄糖可產(chǎn)氫3.47 mol［35］.

2 光生物制氫技術(shù)

2.1 光解水生物制氫技術(shù)

光解水生物制氫主要是指綠藻和藍(lán)細(xì)菌，在厭氧光照條件下，利用自身特有的產(chǎn)氫酶系，將水裂解為氫氣和氧氣的過程，此過程沒有CO2的產(chǎn)生.其產(chǎn)氫機(jī)理和綠色植物光合作用機(jī)理相類似，但放氫機(jī)制卻截然不同.這兩種微生物生長的營養(yǎng)需求較低，只需空氣(CO2和N2分別作為碳源和氮源)、水(電子和質(zhì)子)、簡單的無機(jī)鹽和光，能直接光解水產(chǎn)生氫氣，將太陽能轉(zhuǎn)化為氫能.綠藻在光照和厭氧條件下的產(chǎn)氫則由氫酶催化，而藍(lán)細(xì)菌的產(chǎn)氫則由固氮酶和氫酶的共同催化下完成.兩種生物所需的電子和質(zhì)子均來自于水的裂解.

（1）實(shí)際進(jìn)行建筑電氣安裝工程施工時，需要對電氣系統(tǒng)的絕緣電阻進(jìn)行測試，并對絕緣電阻測試結(jié)果進(jìn)行記錄，然后同時也需要對電氣設(shè)備調(diào)試的結(jié)果進(jìn)行記錄。對于電氣設(shè)備的高度與開關(guān)開啟方向、配線等，都需要與圖紙要求保持一致，此外，室內(nèi)電控箱、電表箱、插座盒、接線盒線頭拼接都需要安裝在一致范圍內(nèi)，以使得安裝線路能夠保持一定的合理性。各個回路線、地線、零線、相線的顏色需要明確標(biāo)準(zhǔn)，并對管線敷設(shè)、設(shè)備、管線與開關(guān)的安裝時間進(jìn)行合理確定，以科學(xué)性的進(jìn)行相關(guān)安裝。

綠藻和藍(lán)細(xì)菌含有2個位于類囊體膜上的光合系統(tǒng)PS I和PS II，PS I的作用主要是生成還原劑用來還原CO2，PS II的功能是水的裂解和氧的釋放.綠藻類囊體膜上的捕光色素吸收光能后被迅速傳遞到PS II(P680)的反應(yīng)中心，然后將水分解為H+和O2，并釋放電子.氧氣透過葉綠體膜進(jìn)入線粒體，被線粒體呼吸作用消耗，同時固定CO2.質(zhì)子被ATP合成酶泵到基質(zhì)，以確保膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度.電子按氧化還原電位依次升高的順序，經(jīng)過類囊體膜上的質(zhì)體醌、細(xì)胞色素等一系列電子傳遞鏈，傳遞至光系統(tǒng)PS I(P700)，在光照條件下進(jìn)行能級躍遷，傳遞給鐵氧還蛋白(Fd)，最終傳給Fe－Fe氫酶的活性中心(HC)［48］.在氫酶的催化下，基質(zhì)中的質(zhì)子和從膜上傳來的電子結(jié)合生成氫氣，產(chǎn)氫過程僅僅維持幾秒至幾分鐘［49－50］.氧分子的存在，對氫酶活性產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制，氧分壓達(dá)到2%時，氫化酶將失去活力，影響到產(chǎn)氫速率和產(chǎn)氫效率［51］.其原因是氧接近［Fe］－氫化酶或［NiFe］－氫化酶的催化位點(diǎn)，致使氫不能與H2－channel結(jié)合，導(dǎo)致氫化酶失活［52］.許多研究者致力于通過不同方法來增加氫酶對氧氣的耐受能力，來延長產(chǎn)氫時間，提高氫氣產(chǎn)量.

2000年，美國Melis等通過“剝奪”萊因綠藻(Chlamydomonas reinhardtil)培養(yǎng)物中的硫來使該藻類的CO2固定、放氧過程和碳消耗、產(chǎn)氫過程相分離，從而細(xì)胞在光照條件下通過光呼吸消耗氧氣，形成厭氧環(huán)境以使氫酶產(chǎn)氫順利進(jìn)行，以間接避免氧氣對產(chǎn)氫的抑制，但是改造后的綠藻產(chǎn)氫量只達(dá)到理論產(chǎn)氫量的15%［53］.根據(jù)這種研究思想，兩步法制氫工藝被成功的應(yīng)用，每升萊茵衣藻產(chǎn)氫速率可達(dá)到約3 mL/h，產(chǎn)氫時間長達(dá)70 h［54－55］.Seribert等［56］人根據(jù)氫酶的可逆催化特性，通過化學(xué)誘變成功篩選到2株耐氧性高出野生藻株10倍左右的誘變藻株，克服了H2和O2生成的不可兼容性，避免氧氣對氫酶的抑制，是綠藻產(chǎn)氫領(lǐng)域的重大突破.然而，在實(shí)際產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化應(yīng)用中仍面臨許多技術(shù)問題.研究表明:光照條件下，氫酶所需的還原力除水外，內(nèi)源性有機(jī)物質(zhì)如淀粉等也可作為產(chǎn)氫的還原力，綠藻白天進(jìn)行光合作用積累的有機(jī)物在黑暗條件下也可通過氫酶發(fā)酵產(chǎn)氫，但產(chǎn)氫效率較低［57］.

而藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)氫則是在固氮酶和氫酶的共同催化下進(jìn)行的，其中固氮酶催化產(chǎn)氫，氫酶吸收產(chǎn)生的氫氣.有異形胞的藍(lán)細(xì)菌主要通過固氮產(chǎn)氫［58］，可分為營養(yǎng)細(xì)胞和異形胞兩種.營養(yǎng)細(xì)胞含光系統(tǒng)I(PS I)和光系統(tǒng)II(PS II)，可進(jìn)行CO2的還原和H2O的光解，釋放O2并產(chǎn)生還原性物質(zhì).產(chǎn)生的還原性物質(zhì)可通過厚壁孔道運(yùn)輸?shù)疆愋伟?，用于異形胞的固氮和產(chǎn)氫.在缺氮條件下，藍(lán)藻絲狀體由普通細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞壁加厚形成一種特化細(xì)胞即異形胞.O2被加厚的細(xì)胞壁有效地阻止進(jìn)入，為異形胞提供了局部低氧或厭氧環(huán)境，利于產(chǎn)氫.正常的營養(yǎng)細(xì)胞在厭氧條件下生長時，異形胞內(nèi)的固氮酶系統(tǒng)可產(chǎn)生固氮酶并固氮.異形胞沒有PS II，只含PS I，所以不能進(jìn)行水的光解放氧和CO2的固定，使異形胞維持在無氧或缺氧的環(huán)境.異形胞的光合磷酸化為固氮酶提供能量，確保固氮產(chǎn)氫過程的順利進(jìn)行［59］.一種絲狀好氧固氮藍(lán)藻如魚腥藻，其細(xì)胞具有異形胞和營養(yǎng)細(xì)胞2種類型［60］.大多數(shù)藻類都是通過固氮催化釋放氫氣，在異形胞與營養(yǎng)細(xì)胞的共同作用下，光解水釋放H2和O2，即固氮放氫的過程.無異形胞單細(xì)胞藍(lán)藻的產(chǎn)氫主要由固氮酶催化，大部分無異形胞的藍(lán)藻由于沒有異形胞而失去了對氧氣的防護(hù)能力，只能在光暗交替情況下釋放H2［61］.

2.2 光發(fā)酵生物制氫技術(shù)

光發(fā)酵生物制氫是在厭氧光照條件下，光發(fā)酵細(xì)菌利用小分子有機(jī)物、還原態(tài)無機(jī)硫化物或氫氣做供氫體，光驅(qū)動產(chǎn)氫，產(chǎn)氫過程沒有氧氣的釋放.光發(fā)酵細(xì)菌只含有光合系統(tǒng)PS I，不含有PS II，所以同綠藻和藍(lán)細(xì)菌相比，在產(chǎn)氫的同時不產(chǎn)生氧氣，不存在氧氣對產(chǎn)氫酶的抑制，產(chǎn)氫純度和產(chǎn)氫效率高，可以簡化工藝過程.光發(fā)酵生物制氫是與光合磷酸化相偶聯(lián)的，由固氮酶催化的放氫過程.同時由于所需ATP來自光合磷酸化，所以固氮放氫所需要的能量來源不受限制，這也是光發(fā)酵細(xì)菌產(chǎn)氫效率高于暗發(fā)酵細(xì)菌的主要原因.

無論在間歇還是連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)氫過程中，菌種都扮演著重要的角色，其性能的優(yōu)良直接影響到生物制氫技術(shù)的成敗.因此，獲取高效產(chǎn)氫的光發(fā)酵細(xì)菌一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn).

Willison通過化學(xué)誘變的方法，篩選到Rhodopseudomonas capsulata B10菌株的膜結(jié)合氫酶缺陷株，生長迅速，該變異株在DL－蘋果酸、L－蘋果酸和D－蘋果酸中的產(chǎn)氫量比野生型菌株提高 10% ～70%［62］.Kim［63］研究了 Rhodobacter sphaeroides KD131的吸氫酶Phb－/Hup－突變株，產(chǎn)氫量明顯提高，為野生型的1倍左右.Tao［64］從廢水池塘中分離獲得一株光發(fā)酵細(xì)菌ZX－5，具有較強(qiáng)的產(chǎn)氫能力，在以琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鈉和丁酸鈉為碳源時，細(xì)胞生長都很好，底物轉(zhuǎn)化效率分別為81.4%、78.9%、69.0%和74.6%，最大氫氣產(chǎn)率分別是94、92、90和110 mL/(L·h).任南琪等［65］從淡水池塘底泥中分離獲得光發(fā)酵細(xì)菌Rhodopseudomonas faecalis RLD－53，該光發(fā)酵細(xì)菌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化乙酸為氫氣的能力，每mol乙酸鹽氫氣產(chǎn)量可達(dá)2.64～2.84 mol.鄭耀通等［66］在魚塘內(nèi)分離到一株生長快的耐氨光發(fā)酵細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides G2B，并結(jié)合處理有機(jī)廢水進(jìn)行產(chǎn)氫研究［67］.

目前，除采用傳統(tǒng)選擇培養(yǎng)和遺傳誘變技術(shù)之外，遺傳工程技術(shù)改造產(chǎn)氫菌株和構(gòu)建多功能基因工程菌是未來發(fā)展的方向.通過誘變或敲除吸氫酶基因，消除菌株的吸氫現(xiàn)象，采用基因重組等手段構(gòu)建基因工程菌也是一種可行性比較強(qiáng)的提高產(chǎn)氫能力的方法.Kim等［68］通過基因重組R.rubrum(pRKhydA和pRKhydC)Fe－氫酶基因，在丙酮酸鹽存在的情況下，氫氣產(chǎn)量增加了約3倍，也說明了Fe－氫酶對丙酮酸具有明顯的依賴性.Kars等［69］通過缺失突變重組獲得了 R. sphaeroides O.U.001的 hupSL缺失突變株，在15 mmol/L蘋果酸鹽和30 mmol/L乙酸鈉的培養(yǎng)基中每升培養(yǎng)基分別產(chǎn)氫2.42 L和0.25 L，較野生型(1.97 l L和0.210 L)明顯提高約20%.

國內(nèi)外研究者相繼展開了各種生活廢水、工業(yè)廢水、農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物等作為產(chǎn)氫底物的研究，以降低光發(fā)酵產(chǎn)氫的成本.

上述研究表明，使用光發(fā)酵細(xì)菌對廢水進(jìn)行處理的同時，既得到清潔能源氫氣、降低制氫成本，又實(shí)現(xiàn)了廢棄物的資源化.

3 暗－光發(fā)酵耦合生物制氫技術(shù)

利用厭氧暗發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌和光發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的優(yōu)勢和互補(bǔ)協(xié)同作用，將二者聯(lián)合起來組成的產(chǎn)氫系統(tǒng)稱為光－暗發(fā)酵耦合生物制氫技術(shù)，包括暗－光發(fā)酵細(xì)菌兩步法和混合培養(yǎng)產(chǎn)氫2種方法.

3.1 暗－光發(fā)酵細(xì)菌混合培養(yǎng)生物制氫

暗發(fā)酵細(xì)菌能夠?qū)⒋蠓肿佑袡C(jī)物分解成小分子有機(jī)酸和醇，以獲得維持自身生長所需的能量和還原力，解除電子積累而快速釋放部分氫氣.由于產(chǎn)生的有機(jī)酸不能被暗發(fā)酵細(xì)菌繼續(xù)分解而大量積累，導(dǎo)致暗發(fā)酵細(xì)菌產(chǎn)氫效率低下，成為暗發(fā)酵細(xì)菌產(chǎn)氫大規(guī)模應(yīng)用面臨的瓶頸問題［74］.而光發(fā)酵細(xì)菌能夠利用暗發(fā)酵產(chǎn)生的小分子有機(jī)酸，消除有機(jī)酸對暗發(fā)酵制氫的抑制作用，進(jìn)一步釋放氫氣.同時光發(fā)酵細(xì)菌不能直接利用纖維素和淀粉等大分子的復(fù)雜有機(jī)物，對廉價的廢棄的有機(jī)資源的直接利用能力和產(chǎn)氫能力較差.所以，充分結(jié)合暗－光發(fā)酵兩種細(xì)菌各自的優(yōu)勢，將二者耦合到一起形成一個高效產(chǎn)氫體系，不僅可以減少光能需求，而且可以提高體系的產(chǎn)氫效率，同時還可擴(kuò)大底物的利用范圍.

目前，光發(fā)酵生物制氫技術(shù)的研究程度和規(guī)模還基本處于試驗(yàn)室水平，暗發(fā)酵生物制氫技術(shù)已完成中試研究［75］，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍需進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，降低制氫成本.純菌種生物制氫規(guī)?；媾R諸多困難，而且自然界的物質(zhì)和能量循環(huán)過程，特別是有機(jī)廢水、廢棄物和生物質(zhì)的降解過程，通常由2種或多種微生物協(xié)同作用.因此，利用微生物進(jìn)行混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵產(chǎn)氫己越來越受到重視.

暗－光發(fā)酵細(xì)菌混合培養(yǎng)是將不同營養(yǎng)類型和性能的微生物菌株共存在一個系統(tǒng)中，構(gòu)建高效混合培養(yǎng)產(chǎn)氫體系，利用這些細(xì)菌的互補(bǔ)功能特性，提高氫氣生產(chǎn)能力及底物轉(zhuǎn)化范圍和轉(zhuǎn)化效率.

Miyake等［76］驗(yàn)證了混合產(chǎn)氫途徑的可行性，暗發(fā)酵細(xì)菌 Clostridium butyricum和光發(fā)酵細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides RV聯(lián)合氫氣產(chǎn)量高達(dá)每摩爾葡萄糖7 mol，而且降低了光發(fā)酵細(xì)菌產(chǎn)氫所需的能量.Yokoi等［77］報道了C.butyricum和Rhodobacter sp.M－19混合培養(yǎng)利用淀粉最大產(chǎn)氫量達(dá)到每摩爾葡萄糖6.6 mol，比單一厭氧菌利用淀粉的產(chǎn)氫量高4倍.鄭耀通和閔航［78］認(rèn)為共固定光－暗兩種發(fā)酵細(xì)菌的混合培養(yǎng)方式是處理高濃度有機(jī)廢水持續(xù)產(chǎn)氫的最佳工藝模式.Asada等［79］采用乳酸菌Lactobacillus delbrueckii NBRC13953和Rhodobacter sphaeroides RV共固定在瓊脂凝膠中產(chǎn)氫，每摩爾葡萄糖最大氫氣產(chǎn)量為7.1 mol.丁杰等［80］利用固定化光發(fā)酵細(xì)菌Rhodopseudomonas faecalis RLD－53和游離的C.butyricum進(jìn)行混合培養(yǎng)產(chǎn)氫，并對產(chǎn)氫過程中的一些關(guān)鍵性因素進(jìn)行分析研究，實(shí)現(xiàn)了一個較高的氫氣產(chǎn)量，每摩爾葡萄糖產(chǎn)氫4.13 mol.Fang等［81］人研究了Clostridium butyricum和Rhodobacter sphaeroides以細(xì)胞數(shù)量比1∶5.9的比例混合培養(yǎng)，每毫升培養(yǎng)基氫氣產(chǎn)量最大為0.6 mL，同時應(yīng)用FISH技術(shù)對混合培養(yǎng)產(chǎn)氫體系中2種菌進(jìn)行了相對定量，認(rèn)為該技術(shù)對于細(xì)菌在混合系統(tǒng)中的定量是有效的方法.然而，由于混合培養(yǎng)的2種類型的細(xì)菌在生長速率、種間差異等上存在著很大差別，實(shí)現(xiàn)其啟動和運(yùn)行是很難實(shí)現(xiàn)的.

3.2 暗光發(fā)酵兩步法生物制氫

相對于混合培養(yǎng)產(chǎn)氫，兩步法產(chǎn)氫更容易實(shí)現(xiàn)，2種菌在各自的環(huán)境中發(fā)揮作用.第一步是暗發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生氫氣，同時產(chǎn)生大量的可溶性小分子有機(jī)代謝物，第二步是光發(fā)酵細(xì)菌依賴光能進(jìn)一步的利用這些小分子代謝物，釋放氫氣.

Nath等［82］嘗試使用 Rhodobacter sphaeroides O.U.001來光發(fā)酵Enterobacter cloacae DM11的代謝產(chǎn)物，整個過程的氫氣量比單一過程的高.Tao等［83］證實(shí)了通過暗－光發(fā)酵細(xì)菌兩步法試驗(yàn)，利用蔗糖作為底物，能夠顯著增加氫氣產(chǎn)量，每摩爾蔗糖氫氣產(chǎn)量最大達(dá)6.63 mol.Liu等［84］通過使用游離的乙醇型發(fā)酵細(xì)菌B49和固定化光發(fā)酵細(xì)菌R.faecalis RLD－53兩步法利用葡萄糖進(jìn)行產(chǎn)氫，每摩爾葡萄糖產(chǎn)氫量達(dá)6.32 mol.Chen等［85］通過使用暗發(fā)酵細(xì)菌Clostridium pasteurianum CH4利用蔗糖作為底物時每摩爾蔗糖可以產(chǎn)生氫氣3.8 mol，通過Rhodopseudomonas palustris WP3－5對上述發(fā)酵液進(jìn)一步處理，每摩爾蔗糖產(chǎn)氫10.02 mol，同時COD去除率達(dá)到72%.當(dāng)使用光纖反應(yīng)器進(jìn)行光發(fā)酵試驗(yàn)時，2個過程氫氣產(chǎn)量進(jìn)一步增加到每摩爾蔗糖產(chǎn)氫14.2 mol，COD去除率幾乎接近90%，顯示了很好的氫氣生產(chǎn)能力和COD處理效果.Lo等［86］對難降解大分子物質(zhì)淀粉進(jìn)行酶解處理后，經(jīng)過暗－光發(fā)酵2個過程即三步法氫氣生產(chǎn)過程，使COD去除率達(dá)到54.3%，每摩爾葡萄糖產(chǎn)氫3.09 mol，這一試驗(yàn)結(jié)果說明:暗－光發(fā)酵的兩步法氫氣生產(chǎn)過程可以結(jié)合一定的預(yù)處理方法實(shí)現(xiàn)難降解大分子有機(jī)物的產(chǎn)氫，降低產(chǎn)氫原料成本，增加底物轉(zhuǎn)化效率，為實(shí)現(xiàn)生物制氫的商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).然而，兩步法產(chǎn)氫過程中，需要2個反應(yīng)器，增加了占地面積和處理步驟，而且光發(fā)酵過程的氫氣生產(chǎn)速率和細(xì)菌生長速率同暗發(fā)酵相比較低，是規(guī)模化生產(chǎn)的限制因素.

4 存在問題

生物制氫技術(shù)雖然發(fā)展較快，然而，該技術(shù)存在的一些主要問題限制了其產(chǎn)業(yè)化的步伐.

1)暗發(fā)酵生物制氫雖然具有產(chǎn)氫穩(wěn)定、速率快等優(yōu)點(diǎn)，但是，由于揮發(fā)酸的積累而產(chǎn)生反饋抑制作用限制了其產(chǎn)氫量.同時其生產(chǎn)和儲運(yùn)設(shè)施不夠完善，嚴(yán)重制約其大規(guī)模應(yīng)用.

2)光生物產(chǎn)氫技術(shù)，光能轉(zhuǎn)化效率低下問題一直困擾著廣大研究者.運(yùn)用基因工程手段改造光發(fā)酵細(xì)菌的光合系統(tǒng)或人工誘變獲取高光能轉(zhuǎn)化效率的光發(fā)酵產(chǎn)氫菌株，深入研究光能轉(zhuǎn)化機(jī)制包括光能吸收、轉(zhuǎn)化和利用方面的機(jī)理，提高光能的利用率，以加快生物產(chǎn)氫的工業(yè)化進(jìn)程.

3)成本問題制約了生物制氫技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用.廉價底物的開發(fā)利用對降低生物制氫的成本至關(guān)重要.重點(diǎn)開展以工農(nóng)業(yè)廢水、城市污水、畜禽廢水等可再生資源以及秸稈等含纖維素類生物質(zhì)為原料進(jìn)行暗發(fā)酵和光發(fā)酵產(chǎn)氫的研究，既可降低生產(chǎn)成本又可凈化環(huán)境.

4)暗－光發(fā)酵耦合系統(tǒng)的協(xié)同系統(tǒng)的生態(tài)共融性問題.暗光發(fā)酵2種細(xì)菌在生長速率、酸的耐受力等方面存在巨大差異，而且暗發(fā)酵產(chǎn)酸速率快，致使體系pH急劇下降，嚴(yán)重抑制光發(fā)酵細(xì)菌的生長，產(chǎn)氫效率降低，這也是混合培養(yǎng)產(chǎn)氫的瓶頸問題.如何使二者充分利用各自優(yōu)勢，發(fā)揮互補(bǔ)功能，解除彼此間的抑制及產(chǎn)物的反饋抑制，提高氫氣生產(chǎn)能力、底物轉(zhuǎn)化范圍和轉(zhuǎn)化效率，是亟需解決的問題.需要研究者不斷的分離篩選同一生態(tài)位的光發(fā)酵和暗發(fā)酵細(xì)菌或改進(jìn)產(chǎn)氫條件，優(yōu)化產(chǎn)氫系統(tǒng)，使二者能夠更好地發(fā)揮協(xié)同產(chǎn)氫作用，使之能夠在同一系統(tǒng)中共存，實(shí)現(xiàn)真正意義上的底物的梯級利用，深度產(chǎn)氫.

5 前景分析

人類賴以依存的化石能源將消耗殆盡，而氫氣正是目前最理想的清潔燃料之一.目前，氫燃料汽車、氫燃料電池等都是以氫氣作為化石能源的替代品.人類對氫燃料的需求也將越來越多，石油、化工、電力、化纖等行業(yè)都大量使用氫，強(qiáng)大的市場需求必將加快氫氣工業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的步伐.氫氣必將成為后化石燃料時代的能源主要供應(yīng)方式之一.

氫氣作為能源是現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)與可持續(xù)發(fā)展的需要.目前，從煤、石油和天然氣等化石燃料中制取氫氣已初具規(guī)模，但從長遠(yuǎn)觀點(diǎn)看，不符合可持續(xù)發(fā)展的需要.成本高是生物制氫技術(shù)沒有產(chǎn)業(yè)化的主要問題，我國可用于生物制氫的原料非常多，如利用工業(yè)廢棄物、城市污水、生活垃圾、動物糞便等有機(jī)廢物以及秸稈等含纖維素類生物質(zhì)發(fā)酵制氫，可大大降低生產(chǎn)成本.暗光發(fā)酵耦合生物制氫技術(shù)可將廢水處理、太陽能利用和清潔能源生產(chǎn)三者有機(jī)結(jié)合，并形成一種新型的環(huán)保企業(yè).因此，無論從環(huán)境保護(hù)，還是從新能源開發(fā)、可持續(xù)發(fā)展的角度來看，發(fā)酵法生物制氫技術(shù)都具有很大的發(fā)展?jié)摿?

［1］NANDI R，SENGUPTA S.Microbial Production of Hydrogen:An Overview［J］.Critical Reviews in Microbiology，1998，24(1):61－84.

［2］COHEN A，GEMERT J M，ZOEREMEYER R J，et al. Main characteristics and stoichiometric aspects of acidogenesis of soluble carbohydrate containing wastewater［J］.Process Biochem，1984，19(6):228－232.

［3］任南琪，王寶貞.有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)［M］.哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1994:32－33.

［4］REN Nanqi，CHUA H，CHAN S Y，et al.Assessing optimal fermentation type for bio－h(huán)ydrogen production in continuous acidogenic reactors［J］.Bioresource Technol，2007，98:1774－1780.

［5］REN Nanqi，WANG Baozhen，HUANG Juchang.Etha－nol－type fermentation from carbohydrate in high rate acidogenic reactor［J］.Biotechnol Bioeng，1997，54(5): 428－433.

［6］任南琪.有機(jī)廢水處理生物產(chǎn)氫原理與工程控制對策研究［D］.哈爾濱:哈爾濱建筑大學(xué)，1993.

［7］任南琪，林明，馬汐平，等.厭氧高效產(chǎn)氫細(xì)菌的篩選及其耐酸性研究［J］.太陽能學(xué)報，2003，24(1):80－84.

［8］XING Defeng，REN Nanqi，LI Qiubo，et al.Ethanoligenens harbinense gen.nov.，sp.Nov.，Isolated from Molasses wastewater［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2006，56:755－760.

［9］李永峰.發(fā)酵產(chǎn)氫新菌種及純培養(yǎng)生物制氫工藝研究［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2005.

［10］KUMAR N，DAS D.Enhancement of Hydrogen Production by Enterobacter cloacae IIT－BT 08［J］.Process Biochemistry，2000，35(6):589－593.

［11］KUMAR N，DAS D.Continuous Hydrogen Production by immobilized Enterobacter cloacae IIT－BT 08 using lignocellulosic maerials as solid matrices［J］.Enzyme and Microbial Technology，2001，29(4/5):280－287.

［12］林明.高效產(chǎn)氫發(fā)酵新菌種的產(chǎn)氫機(jī)理及生態(tài)學(xué)研究［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2002.

［13］REN Nanqi，CAO Guangli，WANG Aijie，et al.Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16［J］. Int J Hydrogen Energy，2008，33(21):6124－6132.

［14］ALZATE－GAVIRIA L M，SEBASTIAN P J，PREZHERNNDEZ A，et al.Comparison of two anaerobic systems for hydrogen production from the organic fraction of municipal solid waste and sythetic wastewater［J］.Int J Hydrogen Energy，2007，32(15):3141－3146.

［15］CHANG J S，LEE K S，LIN P J.Biohydrogen Production with Fixed－bed Bioreactors［J］.Int J Hydrogen Energy，2002，27(11－12):1167－1174.

［16］LIN C N，WU S Y，CHANG J S.Fermentative Hydrogen Production with a Draft Tube Fluidized Bed Reactor Containing Silicone－gel－immobilized Anaerobic Sludge［J］. Int J Hydrogen Energy，2006，31(15):2200－2210.

［17］WU K J，CHANG J S.Batch and continuous fermentative production of hydrogen with anaerobic sludge entrapped in a composite polymeric matrix［J］.Process Biochem，2007，42(2):279－284.

［18］KUMAR N，DAS D.Enhancement of hydrogen production by Enterobacter cloacae IIT－BT 08［J］.Process Biochemistry，2000，35(6):589－593.

［19］JUNG G Y，KIM J R，PARK J Y，et al.Hydrogen production by a new chemoheterotrophic bacterium Citrobacter sp.Y19［J］.Int J Hydrogen Energy，2002，27(6):601－610.

［20］LIN C Y，CHANG R C.Fermentative hydrogen production at ambient temperature［J］.Int J Hydrogen Energy，2004，29(7):715－720.

［21］YU Hangqing，ZHU Zhenhu，HU Wenrong，et al.Hydrogen production from rice winery wastewater in an upflow anaerobic reactor by using mixed anaerobic culture［J］. Int J Hydrogen Energy，2002，27(11/12):1359－1365.

［22］YOKOI H，TOKUSHIGE T，HIROSE J，et al.Hydrogen production by immobilized cells of enterobacter aerogenes strain HO－39［J］.J Fermentation Bioengineering，1997，83(5):481－484.

［23］KATAOKA N，MIYA A，KIRIYAMA K.Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen－producing anaerobic bacteria［J］.Water Science and Technology，1997，36(6/7):41－47.

［24］TAGUCHI F，CHANG JD，TAKIGUCHI S，et al.Efficient hydrogen production from starch by a baterium isolated from termites［J］.J Fermentation Bioengineering，1992，73(3):244－245.

［25］TAGUCHI F，MIZUKAMI N，TAKI T S，et al.Hydrogen production from continuous fermentation of xylose during growth of Clostridium sp.Strain No2［J］.Can J Microbiol，1995，41(6):536－540.

［26］EVVYERNIE D，AMAZAKI A Y，MORIMOTO K，et al.Identification and characterization of Clostridium Paraputrificum M－21，a chitinolytic mesophilic and hydrogen－producing bacterium［J］.J Biosci Bioeng，2000，89(6):596－601.

［27］MONOT F，ENGASSER J，PETITDEMANGE H.Influence of pH and undissociated butyric acid on the production of acetone and butanol in batch cultures of Clostridium acetobutylicum［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1984，19(6):422－426.

［28］LIN C Y，CHANG R C.Hydrogen production during the ananerobic acidogenic conversion of glucose［J］.J Chem Technol Biotechnol，1999，74(6):498－500.

［29］LAY J J，LEE Y J，NOIKE T.Feasibility of biological hydrogen production from organic fraction of municipal solid waste［J］.Water Research，1999，33(11): 2579－2586.

［30］趙春芳，鄺生魯，奚強(qiáng).以葡萄糖為基質(zhì)的消化污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的研究［J］.化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2001，22(4):4－6.

［31］FANG H H P，LIU Hong.Effect of pH on hydrogen production from glucose by a mixed culture［J］.Bioresource Technology，2002，82(1):87－93.

［32］MOHAN S V，BHASKAR Y V，KRISHNA P M，et al. Biohydrogen production from chemical wastewater as substrate by selectively enriched anaerobic mixed consortia:influence of fermentation pH and substrate composition［J］.Int J Hydrogen Energy，2007，32(13): 2286－2295.

［33］CHEONG D Y，HANSEN C L，STEVENS D K.Pro－duction of bio－h(huán)ydrogen by mesophilic anaerobic fermentation in an acid－phase sequencing batch reactor［J］.Biotechnol Bioeng，2007，96(3):421－432.

［34］GUO Wanqian，REN Nanqi，WANG Xiangjing，et al. Optimization of culture conditions for hydrogen production by Ethanoligenens harbinense B49 using response surface methodology［J］.Bioresource Technology，2009，100:1192－1196.

［35］GUO Wanqian，REN Nanqi，WANG Xiangjing，et al. Biohydrogen production from ethanol－type fermentation of molasses in an acidogenic expanded granular sludge bed(EGSB)reactor［J］.Int J Hydrogen Energy，2008，33:4981－4988.

［36］GUO Wanqian，REN Nanqi，CHEN Zhaobo，et al. Simultaneous biohydrogen production and starch wastewater treatment in an acidogenic expanded granular sludge bed reactor by mixed culture for long－term operation［J］.Int J Hydrogen Energy，2008，33: 7397－7404.

［37］FAN Yaoting，ZHANG Yahui，ZHANG Shufang，et al. Efficient conversion of wheat straw wastes into biohydrogen gas by cow dung compost［J］.Bioresource Technology，2006，97(2):500－505.

［38］OKAMOTO M，MIYAHARA T，MIZUNO O，et al.Biological hydrogen potential of materials characteristics of the organic fraction of municipal solid wastes［J］.Wat Sci Tech，2000，41(3):25－32.

［39］LAY J Y.Biohydrogen generation by mesophilic anaerobic fermentation of microcrystalline cellulose［J］.Biotechno Bioeng，2001，74(4):280－287.

［40］VAN GINKEL S，SUNG S，LAY J J.Biohydrogen production as a function of pH and substrate concentration［J］. Environ Sci Technol，2001，35(24):4726－4730.

［41］LAY J Y I.Modeling and optimization of anaerobic digested sludge converting starch to hydrogen［J］.Biotechnol Bioeng，2000，68(3):269－278.

［42］FAN Yaoting，ZHANG Yahui，ZHANG Shufang，et al. Efficient conversion of wheat straw wastes into biohydrogen gas by cow dung compost［J］.Bioresource Technol，2006，97(3):500－505.

［43］FANG HHP，LIU H.Hydrogen production from wastewater by acidogenic granular sludge［J］.Wat Sci Tech，2003，47(1):153－158.

［44］LIN C Y，JO C H.Hydrogen production from sucrose using an aaerobic sequencing batch reactor process［J］.J Chem Technol Biotechnol，2003，78:678－684.

［45］CHANG J S，LEE K S，LIN P J.Biohydrogen production with fixed－bed bioreactors［J］.Int J Hydrogen Energy，2002，27(11/12):1167－1174.

［46］LEE K S，LO Y S，LO Y C，et al.H2production with anaerobic sludge using activated－carbon supported packed－bed bioreactors［J］.Biotechnology Letters，2003，25(2):133－138.

［47］ZHANG Zhenpeng，TAY J H，SHOW K Y，et al.Biohydrogen production in a granular activated carbon anaerobic fluidized bed reactor［J］.Int J Hydrogen Energy，2007，32(2):185－191.

［48］FLORIN L，TSOKOGLOU A，HAPPE T.A novel type of［Fe］－h(huán)ydrogenase in the green alga Scenedesmus obliques is linked to the photosynthetical electron transport chain［J］.J Biol Chem，2001，276:6125－6132.

［49］GAFFRON H.Reduction of carbon dioxide with molecular hydrogen in green algae［J］.Am J Bot，1939，27:273－283.

［50］GAFFTON H，RUBIN J.Fermentative and photochemicali production of hydrogen in algae［J］.J Gen Physio，1942，26:219－240.

［51］GHIRARDI M L，TOGASAKI R K，SEIBERT M.Oxygen sensitivity of algal H2production［J］.Applied Biochemistry Biotechnology，1997，63－65:141－151.

［52］潘麗霞，楊登峰，梁智群.綠藻高效制氫影響因素的研究［J］.中國生物工程雜志，2007，27(4):146－152.

［53］ZHANG L，HAPPE T，MELIS A.Biochemistry and morphological characterization of sulfur－deprived amd H2－producting Chlamydomonas reinhardtii(green alga)［J］.Planta，2002，214(4):552－561.

［54］ANASTASIOS，ZHANG Liping，F(xiàn)ORESTIER M，et al. Sustained photobiologieal hydrogen gas production upon reversible inaetivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii［J］.Plant Physiology，2000，122:127－135.

［55］ANASTASIOS M，THOMAS H.Hydrogen production: Green algae as a source of energy［J］.Plant Physiology，2001，127:740－748.

［56］SERIBERT M，GHIRARDI M L，SERBERT M.Accumulation of O2－tolerant phenotypes in H2－producing strains of Chlamydomonas reinhardtii by sequential application of chemical mutagenesis and selection［J］.Int J Hydrogen Energy，2002，27(11/12):1421－1430.

［57］ZHU Changxi，CHEN Bingjian，SONG Hongyu.Rhodopseudonlonas capsulate membrane union condition hydrogen enzyme physiology electron acceptor archery target research［J］.Acta Micrologica Sinica，1986，26 (4):326－332.

［58］才金玲，王廣策，楊素萍，等.生物制氫研究進(jìn)展［J］.海洋科學(xué)集，2007，48:176－190.

［59］BENEMANN J R.Hydrogen production by microalgae［J］.J Applied Phycology，2000，12(3/4/5):291－300.

［60］KUMAR D，KUMAR H D.Hydrogen production by several cyanobacteria［J］.Int J Hydrogen Energy，1992，17(11):847－852.

［61］朱建良，馮有智.固氮類微生物產(chǎn)氫機(jī)理研究進(jìn)展［J］.南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25(1):102－105.

［62］WILLISON J C，MADERN D，VIGNAIS P M.Increased photoproduction of hydrogen by non－autrophic nutants of Rhodopseudomonas capsulate［J］.Biochem J，1984，219:583.

［63］KIM M S，BAEKA J S，LEEB J K.Comparison of H2accumulation by Rhodobacter sphaeroides KD131 and its uptake hydrogenase and PHB synthase deficient mutant［J］. Int J Hydrogen Energy，2006，31(1):121－127.

［64］TAO Yongzhen，HE Yanling，WU Yongqiang，et al. Characteristics of a new photosynthetic bacterial strain for hydrogen production and its application in wastewater treatment［J］.Int J Hydrogen Energy，2008，33(3):963－973.

［65］REN Nanqi，LIU Bingfeng，DING Jie，et al.Hydrogen production with R.faecalis RLD－53 isolated from freshwater pond sludge［J］.Bioresource Technol，2009，100(1):484－487.

［66］鄭耀通，胡開輝，高樹芳.高效凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖水域紫色非硫光合細(xì)菌的分離與篩選［J］.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，27(3):342－346.

［67］鄭耀通，高樹芳.耐氨光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides G2B處理有機(jī)廢水產(chǎn)氫性能研究 ［J］.武夷科學(xué)，2003，19(1):11－16.

［68］KIN E J，LEE M K，KIM M S，et al.Molecular hydrogen production by nitrogenase of Rhodobacter sphaeroides and by Fe－only hydrogenase of Rhodospirillum rubrum［J］.Int J Hydrogen Energy，2008，33(5):1516－1521.

［69］KARS G，GüNDüZ U，YüCEL M，et al.Evaluation of hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides O.U. 001 and its hupSL deficient mutant using acetate and malate as carbon sources［J］.Int J Hydrogen Energy，2009，34(5):2184－2190.

［70］TAKABATAKE H，SUZUKI K，KO IB，et al.Characteristics of anaerobic ammonia removal by a mixed culture of hydrogen producing photosynthetic bacteria［J］. Bioresource Technology，2004，95(2):151－158.

［71］SHI Xianyang，YU Hanqing.Continuous production of hydrogen from mixed volatile fatty acids with Rhodopseudomonas capsulate［J］.Int J Hydrogen Energy，2006，31(12):1641－1647.

［72］CHEN Chunyen，LU Weibin，LIU Chienhung，et al. Improved phototrophic H2production with Rhodopseudomonas palustris WP3－5 using acetate and butyrate as dual carbon substrates［J］.Bioresource Technology，2008，99(9):3609－3616.

［73］尤希鳳，周靜懿，張全國，等.紅假單胞菌利用畜禽糞便產(chǎn)氫能力的試驗(yàn)研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，39(2):215－217.

［74］DAS D，VEZIROGLU T N.Hydrogen production by biological processes:a survey of literature［J］.Int J Hydrogen Energy，2001，26(1):13－28.

［75］李建政，任南琪，林明，等.有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫中試研究［J］.太陽能學(xué)報，2002，23(2):252－256.

［76］MIYAKE J，MAO X Y，KAWAMURA S.Photoproduction of hydrogen from glucose by a co－culture of a photosynthetic bacterium and Clostridium butyricum［J］.J Ferment Tech，1984，62:531－535.

［77］YOKOI H，MORI S，HIROSE J，et al.H2production from starch by a mixed culture of Clostridium butyricum and Rhodobacter sp.M－19［J］.Biotechnology Letters，1998，20(9):895－899.

［78］鄭耀通，閔航.共固定光合和發(fā)酵性細(xì)菌處理有機(jī)廢水生物制氫技術(shù) ［J］.污染防治技術(shù)，1998，11 (3):187－189.

［79］ASADA Y，TOKUMOTO M，AIHARAY，et al.Hydrogen production by co－cultures of Lactobacillus and a photosynthetic bacterium，Rhodobacter sphaeroides RV［J］.Int J Hydrogen Energy，2006，31(11):1509－1513.

［80］DING Jie，LIU Bingfeng，REN Nanqi，et al.Hydrogen production from glucose by co－culture of Clostridium Butyricum and immobilized Rhodopseudomonas faecalisRLD－53［J］. Int J Hydrogen Energ，2009，34(9):3647－52.

［81］FANG H H P，ZHU Heguang，ZHANG Tong.Phototrophic hydrogen production from glucose by pure and cocultures of Clostridium butyricumand and Rhodobacter sphaeroides［J］.Int J Hydrogen Energy，2006，31 (15):2223－2230.

［82］NATH K，KUMAR A.DAS D.Hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides strain O.U.001 using spent media of Enterobacter cloacae strain DM11［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，68(4):533－541.

［83］TAO Yongzhen，CHEN Yang，WUYongqiang，et al. High hydrogen yield from a two－step process of darkand photo－fermentation of sucrose［J］.Int J Hydrogen Energy，2007，32(2):200－206.

［84］LIU Bingfeng，REN Nanqi，XING Defeng，et al.Biohydrogen production by immobilized R.faecalis RLD－53 using soluble metabolites from ethanol fermentation bacteria E.harbinense B49［J］.Bioresource Technology，2009，100(10):2719－2723.

［85］CHEN Chunyen，YANG Muhoe，YEH Kueiling，et al. Biohydrogen production using sequential two－stage dark and photo fermentation processes［J］.Int J Hydrogen Energy，2008，33(18):4755－4762.

［86］LO Y C，CHEN S D，CHEN C Y，et al.Combining enzymatic hydrolysis and dark－photo fermentation processes for hydrogen production from starch feedstock:A feasibility study［J］.Int J Hydrogen Energy，2008，33(19):5224－5233.