Caspase家族對(duì)大腸癌影響研究進(jìn)展

王小敏 佟樹文 鄭素琴

(華北煤炭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部病理學(xué)教研室 河北 唐山 063000)

腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的失衡是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡調(diào)控失敗，會(huì)引起細(xì)胞(尤其是基因突變細(xì)胞)過度增殖或凋亡減少，從而增加細(xì)胞惡變的潛能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Caspase家族蛋白酶的激活在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，當(dāng)其凋亡不足時(shí)，易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫性疾病等。本文就Caspase對(duì)大腸癌的影響綜述如下。

1 Caspase蛋白酶及其生物學(xué)特征

Caspase全稱為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease)，主要以酶原的形式廣泛存在于細(xì)胞中，一般位于胞質(zhì)，偶見于胞核。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)Caspase蛋白酶家族成員有16種，按其發(fā)現(xiàn)的先后順序在Caspase后以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。在細(xì)胞凋亡中起重要作用的主要有 caspase－8、caspase－9、caspase－3。根據(jù) Caspase結(jié)構(gòu)同源性、功能和底物特異性的不同，分為三大類:凋亡啟動(dòng)組，包括Caspase－2、－8、－9和－10，通過自身活化啟動(dòng)凋亡并調(diào)節(jié)效應(yīng)型Caspase;凋亡執(zhí)行組，包括Caspase－3、－6和－7等，能分解細(xì)胞蛋白，執(zhí)行凋亡;炎癥反應(yīng)組，包括Caspase－1、－4、－5、－11、－12、－13和－14等，其活化與炎癥因子的合成有關(guān)。另有人依據(jù)種系發(fā)生的結(jié)果分析將Caspase分為3個(gè)亞家族:Caspase－1亞家族，包括 Caspase－1、－4、－5、－11、－12、－13和－14;Caspase－2亞家族，只有Caspase－2一個(gè)成員;Caspase－3亞家族，包括 Caspase－3、－6、－7、－8、－9和 －10。

Caspase蛋白酶家族具有以下共同特點(diǎn):①均屬于半胱氨酸蛋白酶;②均以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中;③均含有五肽保守序列 QACXG(Caspase－9X=G，Caspase－8和 Caspase－10X=Q外，其余Caspase家族成員X=R);④活化后具有獨(dú)特的催化活性，將底物在ASP位點(diǎn)后切斷，同時(shí)通過這種方式也能自我活化;⑤可直接或間接地被鈣離子激活，過度表達(dá)都可導(dǎo)致一系列不可逆轉(zhuǎn)的蛋白質(zhì)裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡;⑥底物的特異性，即對(duì)底物序列的特異性識(shí)別，因而酶促反應(yīng)具有高度特異性;⑦轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞可誘導(dǎo)凋亡。

2 Caspase的作用底物

Caspase家族在凋亡發(fā)生的DNA裂解、細(xì)胞形態(tài)等方面起著核心作用，激活的Caspase通過對(duì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)的剪切達(dá)到快速有序的“殺死”細(xì)胞，將凋亡信號(hào)逐級(jí)傳至凋亡底物。目前已有40多種Caspase底物得到發(fā)現(xiàn)。根據(jù)蛋白酶對(duì)其底物酶切后產(chǎn)生作用的后果不同，將其底物分為四大類:第一類是被酶切后活化的底物，如Caspase本身切割可引起自身活化，PKC－δ、P21激活的激酶2(PAK2)、凝脂酶A2、類固醇調(diào)節(jié)組件結(jié)合蛋白(SREBF)等;第二類為酶切后失活的底物，如DNA催化亞單位、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白等;第三類為酶切后改變其結(jié)構(gòu)的蛋白，如A型和B型細(xì)胞核Lamin及Gas2;第四類為酶切后對(duì)凋亡作用尚不清楚的底物PARP[poly(Aop－ribose)polymerase]DNA－PAKs等。

3 Caspase激活途徑

3.1 死亡受體途徑 又稱細(xì)胞外途徑。死亡受體(death receptor，DR)是一類跨膜蛋白，隸屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族。目前發(fā)現(xiàn)至少有8種死亡受體在細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用，主要包括Fas/CD95、TNFR －1、DR －3、－4 和 －5、誘騙受體(Decoy receptor，DcR)等。Fas分子的配體為FasL;TNFR－1配體為TNF－α;DR3為APO－3L，而 DR4H 和 DR5配體為 TRAL、APO－2。當(dāng)靶細(xì)胞表面的配體與各自的受體結(jié)合后，膜上的受體就會(huì)發(fā)生二聚化，存在于胞漿中的結(jié)構(gòu)域就會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)與連接蛋白(fas－associated death domain protein，F(xiàn)ADD)C末端的DD結(jié)合，形成誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合物(death－inducing signal complex，DISC)，從而激活 Caspase－8或Caspase－10，繼而活化下游的執(zhí)行者Caspase－3和Caspase－7，啟動(dòng)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。

3.2 線粒體途徑 又稱細(xì)胞內(nèi)途徑。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放是關(guān)鍵的一步，在凋亡發(fā)生早期線粒體膜電位下降而通透性增加，線粒體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)被釋放出來，包括細(xì)胞色素c、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)、Smac/DIABLO、EndoG等。當(dāng)細(xì)胞的凋亡啟動(dòng)后，Bax蛋白由胞液轉(zhuǎn)至線粒體膜上，細(xì)胞色素C從構(gòu)建的孔隙中進(jìn)入胞液，在dATP的協(xié)助下，Apaf－1發(fā)生活化，與pro－Caspase－9分子中的CARD結(jié)構(gòu)域寡聚化，形成凋亡小體(apoptosome)，促使pro－Caspase－9自身活化，活化的Caspase－9進(jìn)一步激活下游的Caspase－3、－6和－7等，進(jìn)而引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。線粒體自身也含有一定量的Caspase，受凋亡信號(hào)刺激時(shí)會(huì)釋放出來，線粒體內(nèi)部釋放的pro－caspase－3直接參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此推測(cè)可能存在一個(gè)Caspase和線粒體自身反饋的環(huán)，凋亡刺激導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C、AIF、Smac、Caspase釋放，Caspase的活化又促進(jìn)誘發(fā)這一過程，對(duì)于凋亡的加速和凋亡信號(hào)傳遞有十分重要的意義。

3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)途徑 Caspase－12啟動(dòng)Caspase的第三條途徑，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)信號(hào)途徑，是近年來研究發(fā)現(xiàn)的又一條重要的Caspase激活途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)Caspase－12表達(dá)，同時(shí)也導(dǎo)致胞質(zhì)中的Caspase－7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。Caspase－7激活Caspase－12，激活的 Caspase－12由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)面移位至細(xì)胞質(zhì)與激活的Caspase－9結(jié)合，啟動(dòng)ER stress誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]。

Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一種錯(cuò)綜復(fù)雜的生理及病理現(xiàn)象，細(xì)胞外途徑導(dǎo)致 Caspase－8的活化，細(xì)胞內(nèi)途徑導(dǎo)致Caspase－9的活化。無論何種途徑，最終Caspase－3被激活，活化的Caspase－3裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。兩條凋亡途徑能發(fā)生交叉對(duì)話，即通過死亡受體途徑激活的Caspase－8剪切Bid，從而激活Bid，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放激活Caspase－9[5]。Caspase激活除上述的三種主要途徑外，還可能有其它的激活方式，各種途徑之間也并非完全孤立地發(fā)揮作用，細(xì)胞的最終命運(yùn)就在于上述各種信號(hào)途徑相互作用的結(jié)果。

4 Caspase家族的調(diào)控

一級(jí)調(diào)控:Caspase主要以無活性的酶原形式存在;二級(jí)調(diào)控:Bcl一2家族及SMAC/DABLO調(diào)節(jié)procaspase的蛋白水解活化;三級(jí)調(diào)控:活化的Caspase受IAp家族的調(diào)控。這些調(diào)控蛋白在腫瘤中通常存在異常表達(dá)，因此可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

5 Caspase與大腸癌

癌癥是多基因控制的疾病。近年的研究表明，細(xì)胞凋亡和增殖的平衡破壞為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了平臺(tái)[6，7]。凋亡異常導(dǎo)致本該死亡的細(xì)胞被保留下來，其中有些突變的細(xì)胞增殖失控，形成腫瘤。目前關(guān)于Caspase對(duì)大腸癌影響研究較多的主要有以下幾種類型:

5.1 Caspase－1與大腸癌 Caspase－1是Caspase家族中最重要的一員，是炎癥反應(yīng)過程的關(guān)鍵效應(yīng)分子。多項(xiàng)研究表明，通過Caspase補(bǔ)充區(qū)域(cARD)，以CARD/CARD途徑與銜接蛋白Asc特異性結(jié)合原Caspase－1，能使其活化，進(jìn)一步介導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子IL－1和IL－18等的成熟與活化，從而引起炎癥反應(yīng)[8]。

江興林等應(yīng)用免疫組化法對(duì)30例結(jié)腸癌標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行Caspase－l檢測(cè)，陽性率分別為60%(18/30)和3O%(9/30)，組間陽性表達(dá)率有非常顯著性差異(P＜0.05)，提示Caspase－1在結(jié)腸癌的凋亡、發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用[9]。

5.2 Caspase－3與大腸癌 Caspase－3是是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)分子，被稱為死亡蛋白酶。它一般以23ku的無活性前體存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡時(shí)才被激活，參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

曾浩然等采用免疫組化法和原位末端標(biāo)記法分別檢測(cè)28例大腸癌、10例大腸腺瘤及5例正常大腸黏膜中Caspase－3基因的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示Caspase－3基因在大腸癌、大腸腺瘤和正常黏膜組織中的表達(dá)分別為46.4%(13/28)、60.0%(6/10)和80.0%(4/5)，三者之間有顯著性差異(P ＜0.01)[10]。與鄧文英等[11]的研究結(jié)果一致，提示 Caspase －3 基因參與了大腸癌的發(fā)生及去分化過程。Larmonier等研究得出大鼠的結(jié)直腸癌組織在脂質(zhì)A的誘導(dǎo)下激活Caspase－3基因，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，而引起腫瘤的退化[12]。

5.3 Caspase－8與大腸癌 Caspase－8主要在胚胎早期起作用，Caspase－8基因甲基化、基因突變及其它表達(dá)異常與某些腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。結(jié)直腸癌組織及多種腫瘤細(xì)胞系檢測(cè)到Caspase－8基因突變，并表現(xiàn)出凋亡受損[13]。Kim等檢測(cè)到結(jié)直腸癌中Caspase－8基因突變率為5.1%，腫瘤來源的突變體表現(xiàn)出明顯減弱的凋亡活性[14]。

5.4 Caspase－9與大腸癌 Caspase－9屬于上游起始Caspase，主要在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中活化，從而激活效應(yīng)Caspase－3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase－9普遍表達(dá)于神經(jīng)、肌肉、肝臟、脾臟、肺和胃等正常組織[15]。有研究表明，在胃癌、皮膚黑色素瘤和白血病中都發(fā)現(xiàn)Caspase－9基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的下調(diào)[16]。

沈小鋼、韓崢等采用RT－PCR測(cè)定大腸癌組織及癌旁組織中Caspase－9mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示與癌旁組織比較，Caspase－9在大腸癌中表達(dá)下調(diào)，二者差異有顯著性(P＜0.05)。提示Caspase－9在大腸癌的發(fā)病中參與了腫瘤組織的分化[17，18]。

5.5 Caspase－14與大腸癌 栗琴應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)大腸組織中Caspase－14的表達(dá)，Caspase－14在正常組、腺瘤組、高分化腺癌組、中分化腺癌組、低分化腺癌組中的陽性表達(dá)率分別為95%、90%、58%、30%和25%，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.001)，分化程度越低，Caspase－14 表達(dá)越低[19]。與Krajewska等的報(bào)道一致[20]。

除 Caspase－1、3、8、9 和 14 外，Caspase凋亡通路中其它組份與大腸癌的相關(guān)性及Caspase通路對(duì)大腸癌的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

大腸癌是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異所致的疾病，多種癌基因的激活和抑癌基因的失活及正常凋亡機(jī)制的紊亂在這一過程中起著重要的作用。近年來對(duì)促細(xì)胞凋亡基因的深入研究已成為分子腫瘤學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)。Caspase家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子群，它們通過切斷與周圍細(xì)胞的聯(lián)絡(luò)、重組細(xì)胞骨架、關(guān)閉DNA復(fù)制和修復(fù)、破壞DNA和核結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)凋亡小體的形成。明確其機(jī)制及調(diào)控過程，無疑是防治腫瘤和其它疾病研究的重要方面。正是由于Caspase在細(xì)胞凋亡機(jī)制中的重要作用及其特性，針對(duì)它們來進(jìn)行凋亡保護(hù)以及凋亡調(diào)控機(jī)制的研究日益廣泛。相信隨著對(duì)Caspase系統(tǒng)研究的深入，Caspase上游基因和下游的作用底物及各種協(xié)作因子將一一被闡明，促Caspase因子和拮抗因子將制成藥品推向市場(chǎng)，對(duì)有關(guān)疾病產(chǎn)生細(xì)胞凋亡獨(dú)特機(jī)制的深入了解，有可能用于某種腫瘤和某種疾病的治療，從而開辟基因治療的新領(lǐng)域。

[1]Henning RS，Juliane M，Hwain S，et al.Pro － Caspase － 3 is a major hysiologic target of Caspase[J].The Journal of Biological Chemistry，1998，273(42):27084

[2]Anichini A，Mortarini R，Sensi M，et al.APAF － 1 signaling in human melanoma[J].Cancer Lett，2006，238:168

[3]Rammohan VR，Evan H，Susana CO，et al.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program[J].Biol Chem，2001，276:3869

[4]Thomberry NA，Lazebnik Y.Caspases:Enemines ithin[J].Science，1998，281(5381):1312

[5]Chen M，Guerrero AD，Huang L，et a1.Caspase － 9 induced mitochondrial disruption through cleavage of anti－apoptotic BCL－2 family members[J].Biol Chem，2007，282(46):33888

[6]Fulda S.Cell death in hematological tumors[J].Apoptosis:An international Journal On Programmed Cell Death，2009，14(4):409

[7]Zhen HN，Zhang X，Hu PZ，et al.Survivin expression and its relation with Proliferation，Apoptosis and angiogenesis in brain liomas[J].Cancer，2005，104(12):2775

[8]Franchi L，Kanneganti TD，Dubyak GR，et al.Differential Requirement of P2X7 Receptor and Intracellular K+for Caspase－1 Activation Induced by Intracellular and Extracellular acteria[J].Chem，2007，282(26):18810

[9]江興林，左云飛.ASC與Caspase－1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J].懷化醫(yī)專學(xué)報(bào)，2008，7(2):11

[10]曾浩然，劉學(xué)勇，陳德志，等.Caspase－3基因在大腸癌、大腸腺瘤中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國廠礦醫(yī)學(xué)，2008，21(5):515

[11]鄧文英，羅素霞，陳小兵，等.Bcl－2、Caspase－3在大腸癌中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(12):2363

[12]Larmonier CB，Amould L，Larmonier N，et al.Kinetics of tumor cell apoptosis and immune cell activation during the regression of tumors induced by lipid A in a rat model of colon cancer[J].Int J Mol Med，2004，13(3):355

[13]Liu B，eng D，Lu Y，et a1.A novel single amino acid deletion caspase－8 mutant in cancer cells that lost proapoptotic activity[J].Biol Chem，2002，277:30159

[14]Kim HS，Lee JW，Soung YH，et al.Inactivating mutations of caspase－8 gene in colorectal carcinomas[J].Gastroenlerology，2003，125(3):708

[15]Lemaire C，Godefroy N，Costina－ Parvu I，et a1.Caspase－9 can antagonize p53－induced apoptosis by generating a p76(Rb)truncated form of Rb[J].Oncogene，2005，24(20):3297

[16]Frank 0，Brors B，F(xiàn)abarius A，et a1.Gene expression signature of primary imatinib － resistant chronic myeloid leukemia patients[J].Leukemia，2006，20(8):1400

[17]沈小鋼，周總光，王 存，等.Caspase－9在結(jié)直腸正常黏膜和癌中的表達(dá)[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(17):2978

[18]韓 崢，鄧長生.Apaf－1和Caspase－9在大腸癌中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志，2008，16(26):3012

[19]粟 琴.Annexin－11和Caspase－l4在大腸癌組織中的表達(dá)及與腫瘤分化的意義[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2009，22(1):24

[20]Krajewska M，Kim H，Shin E，et al.Tumor－ associated alterations in caspase－ 14 expression in epithelial malignancies[J].Clin cancer Res，2005，11(15):5462