電子基因芯片 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)大腸埃希菌 O157∶H7 方法建立

曹娜娜，黃紅蘭，趙春燕

·技術(shù)與方法·

電子基因芯片 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)大腸埃希菌 O157∶H7 方法建立

曹娜娜，黃紅蘭，趙春燕

Nanogene 公司研制的電子基因芯片利用電子場(chǎng)、熱循環(huán)或化學(xué)技術(shù)等吸引帶負(fù)電的 DNA、RNA 或其他生物分子和探針結(jié)合到芯片特定位點(diǎn)上進(jìn)行雜交檢測(cè)[1]。Nanogene電子芯片具有精確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，對(duì)生物分子的電子吸引力大大加速了分子結(jié)合到芯片上的速度，與傳統(tǒng)的被動(dòng)式芯片（如 Affymetrix、Genechip）相比，提高了 1000 倍以上。通常被動(dòng)式芯片的點(diǎn)樣需要花幾個(gè)小時(shí)，而主動(dòng)式電子芯片僅需要 30 ～ 60 s。

我們?cè)⒘艘环N等溫網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增技術(shù)（ramification amplification method，RAM），該方法利用環(huán)形探針和捕獲探針?lè)蛛x和檢測(cè)靶序列，當(dāng)環(huán)形探針與靶基因結(jié)合時(shí)，在連接酶的作用下以共價(jià)鍵連接成環(huán)狀。然后，延著環(huán)形探針聚合酶延伸連接的正向引物，置換下游鏈，產(chǎn)生多聚 ssDNA，這個(gè)過(guò)程類似噬菌體體內(nèi)復(fù)制過(guò)程。再以多聚 ssDNA 作為模板，反向引物與它雜交、延伸、置換下游鏈，產(chǎn)生大的分枝復(fù)合物，導(dǎo)致指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，整個(gè)反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行[2]。RAM 具有和 PCR 一樣的靈敏度，而且等溫?cái)U(kuò)增不需要溫度循環(huán)儀，在任何條件下均可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將 RAM 方法與電子芯片有機(jī)結(jié)合起來(lái)，在電子芯片上進(jìn)行 RAM 擴(kuò)增，以大腸埃希菌的產(chǎn)志賀樣毒素 O157志賀毒素基因 2（shiga toxin 2，stx2）作為檢測(cè)靶基因，確定該方法的可行性，使電子芯片技術(shù)有更廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 從臨床標(biāo)本和食品中分離的 33 株菌株，其中 E.coli O157∶H7 23 株，E.coli O26∶H11 2 株，E.coli O111∶NM 1 株，痢疾志賀菌 3 株，血清型未確定的 4 株，分別由美國(guó)馬里蘭大學(xué)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心流行病所惠贈(zèng)及本室分離鑒定保存；大腸埃希菌 ATCC23716 作為陰性對(duì)照菌株。

1.1.2 試劑 異硫氫酸胍、0.5% 牛血清白蛋白、0.5% 十二烷基鈉、組氨酸緩沖液、DMSO 均為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；Taq DNA 連接酶、Bst DNA 聚合酶為美國(guó) New England Biolabs 公司產(chǎn)品；T4 Gene 32 蛋白為美國(guó) United States Biochemical 公司產(chǎn)品；dNTP 為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；EDTA 為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；Tris 為長(zhǎng)春寶泰克生物科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Nanogen 電子芯片工作系統(tǒng) Nanogen 電子芯片工作系統(tǒng)包括三個(gè)部分：微電子芯片、上樣系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。微電子芯片是由 100 個(gè)或 400 個(gè)位點(diǎn)組成的半導(dǎo)體微電子芯片。上樣系統(tǒng)是通過(guò)電流將帶負(fù)電荷的 DNA 分子從96 孔板上樣到微電子芯片上。檢測(cè)系統(tǒng)是用于檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，還可以通過(guò)提高反應(yīng)溫度和低鹽溶液洗滌降低非特異性雜交和背景干擾。微電子芯片固定在一個(gè)卡套內(nèi)，表面的位點(diǎn)是由許多微電極構(gòu)建，微電極間由微電路連接，通過(guò)對(duì)微電極的電位控制，在微電極的上方完成探針?lè)肿拥倪x擇性固著、靶核酸定向轉(zhuǎn)移集中并與探針主動(dòng)雜交，未雜交或錯(cuò)配雜交序列的去除等過(guò)程。

1.2.2 標(biāo)本處理 將菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上 37 ℃ 培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落放在離心管中，用生理鹽水洗 2 次，然后溶于 100 μl 5 mol/L 異硫氫酸胍（guanidium thiocyanate，GTC），0.5% 牛血清白蛋白，80 mmol/L EDTA，400 mmol/L HCl（pH 7.5），0.5% 十二烷基鈉，100 ℃ 煮沸 10 min，60 ℃ 過(guò)夜，將裂解的標(biāo)本 –20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 環(huán)形探針、靶基因、引物和檢測(cè)探針與報(bào)告探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)志賀樣毒素 2 基因（GenBank #X07865）設(shè)計(jì)環(huán)形探針和捕獲探針，環(huán)形探針兩端與靶基因互補(bǔ)區(qū)為25 個(gè)堿基，連接區(qū)大約為 70 個(gè)堿基。RAM 引物序列參考文獻(xiàn)[3-5]，具體序列見(jiàn)表 1。以上探針和引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.4 在電子芯片上 RAM 反應(yīng)過(guò)程 將下面的各種反應(yīng)液、洗液加到同一個(gè) 96 孔板的不同孔內(nèi)，進(jìn)行如下反應(yīng)：

表 1 環(huán)形探針、RAM 引物、合成靶基因及探針序列

將生物素標(biāo)記的上游引物結(jié)合到芯片的不同位點(diǎn)上，電流為 0.6 μA，60 s，然后用 50 mmol/L 組氨酸洗滌芯片4 次；將 25 mmol/L 磷酸化環(huán)形探針和 1 μl 靶基因結(jié)合到已結(jié)合了引物的位點(diǎn)上，電流 0.995 μA，120 s，再用50 mmol/L 組氨酸洗芯片 4 次；將連接反應(yīng)液結(jié)合到上述芯片位點(diǎn)上，反應(yīng)液包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6），25 mmol/L 乙酸鉀，10 mmol/L 乙酸鎂，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NAD，1 mmol/L TritonX-100，10 U Taq DNA 連接酶，電流 0.9 μA，120 s，然后將反應(yīng)溫度提高到 60 ℃，反應(yīng) 10 min；降低芯片溫度至室溫，用 0.5 mmol/L KiPO4（435 mmol/L K2HPO4和 65 mmol/L KH2PO4）洗滌芯片4 次；將 RAM 反應(yīng)擴(kuò)增液結(jié)合到上述芯片位點(diǎn)上，擴(kuò)增液包括：300 μmol/L dNTP，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8），10 mmol/L KCl，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100，1.2 μmol/L 正向引物，1.2 μmol/L 反向引物，6.4 U Bst DNA聚合酶，4 ng T4Gene32 蛋白，6% DMSO。電流 0.9 A，120 s，反應(yīng)溫度 60 ℃，反應(yīng) 10 min。最后將檢測(cè)探針和報(bào)告探針?lè)謩e結(jié)合到上述芯片位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，電流 0.9 A，120 s。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的引物對(duì)芯片上 RAM 擴(kuò)增的影響

為了確定引物最佳反應(yīng)濃度，我們將不同濃度的生物素標(biāo)記引物 500、250、125、62.5、31 nmol/L 結(jié)合到芯片不同位點(diǎn)上，且每個(gè)引物結(jié)合四個(gè)相同的位點(diǎn)，然后將磷酸化的環(huán)形探針和合成的靶基因結(jié)合上述位點(diǎn)上，每個(gè)位點(diǎn)的連接反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)是一致的，結(jié)果見(jiàn)圖 1。從圖 1 可見(jiàn)，隨著引物濃度的增加，RAM 擴(kuò)增效率也隨著增加，當(dāng)引物濃度達(dá)到 125 nmol/L 和 250 nmol/L，RAM 擴(kuò)增效率較高（F = 3.659，P ＜ 0.01），因此，在以后實(shí)驗(yàn)中我們所用的引物濃度為 125 nmol/L。

2.2 電子芯片 RAM 擴(kuò)增特異性分析

我們先將相同濃度（125 nmol/L）的生物素標(biāo)記引物結(jié)合到芯片上，然后再分別將磷酸化環(huán)形探針與不同菌株的靶基因，包括產(chǎn)志賀毒素 2 的 E.coli O157∶H7，不產(chǎn)志賀毒素 2 的 E.coli O26∶H11、E. coli O111∶NM、痢疾志賀菌和E.coli ATCC23716 分別結(jié)合到已結(jié)合了引物的位點(diǎn)上，進(jìn)行 RAM 擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖 2。從圖 2 可見(jiàn)，只有產(chǎn)志賀毒素 2 的 E.coli O157∶H7 擴(kuò)增效率最高，而其他的菌株未被擴(kuò)增，表明在芯片上 RAM 的擴(kuò)增是對(duì)特異的靶基因擴(kuò)增（F = 1.275，P ＜ 0.01）。

2.3 在電子芯片上進(jìn)行 RAM 擴(kuò)增檢測(cè)臨床標(biāo)本和食品中分離的大腸埃希菌 O157：H7

我們利用電子芯片 RAM 擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)了臨床標(biāo)本和食品中分離的大腸埃希菌 O157∶H7 志賀毒素 2 基因，見(jiàn)圖 3。從圖 3 可見(jiàn)，在芯片位點(diǎn)可見(jiàn)到較強(qiáng)的熒光即為檢測(cè)志賀毒素 2 基因陽(yáng)性的 O157∶H7。

圖 2 電子芯片 RAM 特異性檢測(cè)

圖 3 電子芯片 RAM 擴(kuò)增檢測(cè)臨床標(biāo)本和食品中分離的大腸埃希菌 O157∶H7

3 討論

近年來(lái)，DNA 基因芯片技術(shù)廣泛用于基因表達(dá)的檢測(cè)，而且這些 DNA 基因芯片檢測(cè)技術(shù)通常先進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后再通過(guò)雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。它們通常用于檢測(cè)一個(gè)生物基因組中的很多基因，普通的 DNA 芯片技術(shù)都是被動(dòng)地將基因雜交到芯片上，而且一個(gè)樣本被雜交到整個(gè)芯片上，因些這種方法不能用于在同一個(gè)芯片上檢測(cè)多個(gè)病原體。電子 DNA 芯片技術(shù)能克服常規(guī)基因芯片的不足，它是將 DNA 主動(dòng)地雜交到芯片指定位點(diǎn)上，這樣在電子芯片上可進(jìn)行多重性分析，在同一個(gè)芯片上可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣品的多個(gè)基因，或一個(gè)基因的多個(gè)樣品，或多個(gè)樣品的多個(gè)基因。目前 Nanogene 電子基因芯片技術(shù)已用于多種檢測(cè)如單鏈置換擴(kuò)增分析[6]、單核苷酸多肽性分析（single nucleotide polymorphism，SNP）[7]、點(diǎn)基因突變、基因表達(dá)圖譜[8]、簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列分析[9]、免疫學(xué)檢測(cè)以及病原生物檢測(cè)[10]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們將 RAM 與電子 DNA 芯片技術(shù)結(jié)合起來(lái)，在電子 DNA 芯片上進(jìn)行 RAM 擴(kuò)增并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，節(jié)約了反應(yīng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)生物標(biāo)記的引物濃度為 125 mmol/L，RAM 擴(kuò)增效率達(dá)到最高，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。而且我們將不同菌株靶基因結(jié)合到芯片上，結(jié)果表明，只有產(chǎn)志賀毒素 2 菌株靶基因的擴(kuò)增效率最高，證實(shí)在電子芯片上 RAM 擴(kuò)增是依賴于特異的靶基因，說(shuō)明 RAM具有較高的特異性。而且我們又進(jìn)一步在電子芯片上用RAM 檢測(cè)了臨床標(biāo)本和食品中分離不同的 E.coli O157∶H7菌株，證實(shí)了此種方法的可行性，我們將該方法進(jìn)一步完善，使之有更廣泛的臨床和科研應(yīng)用前景。

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基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（2008Z001）

作者單位：130021 長(zhǎng)春，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物系

通訊作者：趙春燕，Email：chunyanzhao44@yahoo.com

收稿日期：2010-09-21

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.012