雙重染色標(biāo)記胃癌前哨淋巴結(jié)的臨床應(yīng)用研究

劉 飛,程 翔

(湖北省荊門市石化醫(yī)院 448000)

前哨淋巴結(jié)活檢(sentinel lymph node biopsy,SLNB)最早于1977年Cabanas[1]在研究陰莖癌時(shí)觀察到了陰莖癌SLN的存在,現(xiàn)廣泛運(yùn)用于乳腺癌和黑色素瘤等惡性腫瘤,其預(yù)測(cè)腫瘤周圍淋巴結(jié)狀態(tài)的準(zhǔn)確性超過(guò) 95.0%,假陰性率低于5.0%[2-3],但對(duì)胃癌的適用性和可行性尚有爭(zhēng)議。程黎陽(yáng)等[4]應(yīng)用生物染料和核素聯(lián)合示蹤法使SLNB的假陰性率降至6.0%,但聯(lián)合示蹤法有放射性污染且設(shè)備昂貴,不易普及。因此,有必要尋找一種廉價(jià)、簡(jiǎn)便的方法。馮虎翼和高根五[5]應(yīng)用多重染料示蹤腋窩前哨淋巴結(jié)取得了良好的效果。本研究意在通過(guò)應(yīng)用雙重染料標(biāo)記方法評(píng)估前哨淋巴結(jié)預(yù)測(cè)胃癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的價(jià)值及其指導(dǎo)胃癌淋巴結(jié)清掃范圍的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年 2月至 2009年2月在本院治療的胃癌患者32例。術(shù)前均行電子胃鏡檢查,病理證實(shí)為胃癌。所有病例術(shù)前未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。全部病例均行標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù)(胃癌切除+D2式區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù))。32例胃癌患者詳細(xì)病理資料:(1)腫瘤部位:U為3例,M為4例,L為25例;(2)腫瘤大小:直徑范圍0.6～6.5 cm,平均直徑 3.9 cm;(3)腫瘤浸潤(rùn)深度:T1為5例,T2為16例,T3為11例;(4)腫瘤分化程度:高分化3例,中分化16例,低分化13例。

1.2 材料 專利藍(lán)C27H31N2NaO6S2分子量為566.66(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)配制滅菌并分裝成2%的溶液備用,吲哚菁綠C43H47N2NaO6S2分子量為774.96(沈陽(yáng)濟(jì)世制藥有限公司25 mg/支)。免疫組化染色試劑盒,濃縮型DAB試劑盒,鼠抗人癌胚抗原(CEA)單克隆抗體,鼠抗人細(xì)胞角蛋白20(CK20)單克隆抗體(上海水源生物有限公司)。

1.3 SLN標(biāo)記及檢出方法 開(kāi)腹后,對(duì)符合研究條件者,于原發(fā)腫瘤灶周圍的正常胃壁選取對(duì)稱的 2、4、6、8、10、12點(diǎn)共6個(gè)點(diǎn),用連接7號(hào)針頭的5 mL注射器抽取專利藍(lán)和吲哚菁綠分別注射于2、6、10和4、8、12點(diǎn)處漿膜下0.8 mL,注射后數(shù)秒即可見(jiàn)到染料沿著淋巴管向遠(yuǎn)處延伸(見(jiàn)彩插Ⅱ圖1),3～5 min后待染色淋巴結(jié)(見(jiàn)彩插Ⅱ圖2)即SLN出現(xiàn),剝離、切除之,10%福爾馬林溶液固定,同時(shí)標(biāo)注其所屬的組別、站數(shù)。術(shù)畢沿大彎側(cè)縱行剖開(kāi)胃腔,明確并記錄癌腫的確切部位、大小等,查找、切除遺留下的未藍(lán)染淋巴結(jié)(nSLN),標(biāo)注其所屬的組別、站數(shù),并確認(rèn)染料未注入胃腔內(nèi)。

1.4 手術(shù)方法 所有患者行標(biāo)準(zhǔn)根治性胃切除術(shù)(胃癌切除+D2式區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù))。

1.5 病理檢查 將所有淋巴結(jié)和大體標(biāo)本送本院病理科行常規(guī)HE染色檢查、CEA和CK20 IHC染色檢查。(具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)執(zhí)行)。

1.6 結(jié)果判斷 免疫組織化學(xué)(IHC)染色陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):將細(xì)胞漿或胞核中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒的細(xì)胞定義為陽(yáng)性細(xì)胞,含有這類細(xì)胞的淋巴結(jié)即定為陽(yáng)性淋巴結(jié)(癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié))。HE染色檢測(cè)陰性而IHC染色檢測(cè)陽(yáng)性的淋巴結(jié)均視為微轉(zhuǎn)移(micrometastasis,MM)(見(jiàn)彩插Ⅱ圖3、4)。每張切片由2名病理醫(yī)師分別進(jìn)行判斷。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以檢出率、敏感性、準(zhǔn)確性、假陰性率等作為胃癌SLN檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo),各指標(biāo)定義參照文獻(xiàn)[6],研究數(shù)據(jù)行χ2檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 SLN檢出結(jié)果 32例中共有31例找到SLN,檢出率為96.9%(31/32),其中專利藍(lán)檢出26例,檢出率為81.3%(26/32),吲哚菁綠檢出25例,檢出率為 75.8%(25/32)。31例患者共檢出SLN 130枚,檢出范圍1～11枚/例,平均4.2枚/例;其中同時(shí)被專利藍(lán)和吲哚菁綠標(biāo)記SLN占105枚,僅被專利藍(lán)標(biāo)記的SLN占17枚,僅被吲哚菁綠標(biāo)記SLN 8枚,合計(jì)占19.2%(25/130);術(shù)后收集nSLN共獲得414枚,平均12.8枚/例。

2.2 SLN的分布 在31例檢出SLN的患者中僅在N1者16例,僅在N2者2例,同時(shí)在 N1和 N2者10例,同時(shí)在 N1+N2+N3者3例,胃癌SLN大部分分布在臨近病灶的胃周圍(N1)51.6%(16/31),但也有總數(shù)達(dá)6.5%(2/31)的首先轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)僅發(fā)生在遠(yuǎn)離胃癌病灶的N2或N3區(qū)域,可將其視為胃癌淋巴結(jié)的“跳躍性”轉(zhuǎn)移。

2.3 HE染色檢查 SLN轉(zhuǎn)移率為35.3%(46/130),非SLN轉(zhuǎn)移率為7.0%(29/414),兩者轉(zhuǎn)移率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=67.03,P＜0.05)。31例被雙重染色標(biāo)記的病例中有 21例SLN存在轉(zhuǎn)移,其中18例非前哨淋巴結(jié)(nSLN)亦存在轉(zhuǎn)移,3例SLN為胃周淋巴結(jié)惟一轉(zhuǎn)移部位。有10例SLN無(wú)轉(zhuǎn)移,其中1例nSLN存在轉(zhuǎn)移。SLN預(yù)測(cè)胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的敏感性為95.5%(21/22),假陰性率為4.55%(1/22),準(zhǔn)確率為96.8%(30/31);當(dāng)僅計(jì)算專利藍(lán)標(biāo)記SLN預(yù)測(cè)胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的假陰性率為18.18%(4/22),當(dāng)僅計(jì)算吲哚菁綠標(biāo)記SLN預(yù)測(cè)胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的假陰性率為22.72%(5/22)。3種染色標(biāo)記的假陰性率結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 免疫組織化學(xué)(IHC)染色檢查 HE染色檢查SLN無(wú)轉(zhuǎn)移的10例患者中有3例IHC檢查證實(shí)為微轉(zhuǎn)移,544枚淋巴結(jié)中HE染色檢查無(wú)轉(zhuǎn)移的469枚淋巴結(jié)中有39枚證實(shí)為轉(zhuǎn)移陽(yáng)性,其中SLN 15枚,nSLN 24枚,其中雙重染色標(biāo)記的SLN有10枚,專利藍(lán)標(biāo)記的SLN有2枚,吲哚菁綠標(biāo)記的SLN有3枚。使用IHC染色檢查胃癌SLN淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)及轉(zhuǎn)移度均高于常規(guī)HE染色,但兩種病理檢查結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.38,P＜0.05)。

3 討 論

前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)(sentinel lymph node biopsy,SLNB)是近十多年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種外科技術(shù),其在黑色素瘤和乳腺癌中已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐[7-8]。但是人們對(duì)于SLNB應(yīng)用于胃癌的治療一直存在懷疑,主要是因?yàn)槲赴┑牧馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移較乳腺癌、黑色素瘤有其特殊性,胃的淋巴結(jié)引流是多向性的,包括胃大小彎、賁門左右和幽門上下組淋巴結(jié)的引流,因此,胃癌SLN檢測(cè)應(yīng)以實(shí)際的SLN顯影結(jié)果為依據(jù),其數(shù)量有可能超過(guò)1個(gè),出現(xiàn)多個(gè)是可以接受的。國(guó)外已有文獻(xiàn)[9]報(bào)道胃癌SLNB檢出的準(zhǔn)確率達(dá)96%～100%,并在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的前哨淋巴結(jié)的位置,絕大多數(shù)屬于第 1站淋巴結(jié),很少位于第 2、3站淋巴結(jié)。符合胃的淋巴結(jié)引流一般規(guī)律,即首先到達(dá)第1站,然后到達(dá)第2、3站。本研究結(jié)果顯示:胃癌SLN絕大多數(shù)分布于病灶附近的淋巴結(jié)群,即以 No.3、No.4、No.6、No.5、No.l和 No.2最多見(jiàn),占89.2%(116/130),與文獻(xiàn)報(bào)道相近[10-12]。轉(zhuǎn)移的SLN也大部分分布在病灶附近的淋巴結(jié)群。由此可認(rèn)為:同黑色素瘤和乳腺癌一樣,胃的淋巴結(jié)引流同樣具有有序性,胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移同樣遵循由近及遠(yuǎn)的規(guī)律。

實(shí)施SLNB的前提是找到真正的SLN,目前常用的技術(shù)有染料法、同位素法以及二者聯(lián)合應(yīng)用的方法。程黎陽(yáng)等[4]作了比較研究后認(rèn)為,核素和核素聯(lián)合染料較單獨(dú)使用染料法有更高的成功率。但是核素法存在需要特殊設(shè)備、操作復(fù)雜、術(shù)中存在安全隱患、術(shù)后處理環(huán)節(jié)復(fù)雜等缺點(diǎn),不易推廣應(yīng)用。單獨(dú)使用一種生物染料檢測(cè)胃癌SLN的假陰性率較高[13],達(dá)11.4%～13.3%,這是臨床應(yīng)用所不能接受的。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用專利藍(lán)和吲哚菁綠雙重染料聯(lián)合示蹤法用于胃癌的前哨淋巴結(jié)活檢。32例患者中,有31例通過(guò)跟蹤染色的淋巴管找到了染色的淋巴結(jié)。因此,雙重染料聯(lián)合示蹤法用于胃癌的前哨淋巴結(jié)是一種更簡(jiǎn)單、更經(jīng)濟(jì)同時(shí)滿足臨床要求一種方法。

SLNB的主要目的是通過(guò)SLN組織學(xué)狀態(tài)預(yù)測(cè)整個(gè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況,準(zhǔn)確判定SLN的轉(zhuǎn)移狀態(tài)是SLNB準(zhǔn)確預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的一個(gè)關(guān)鍵,從而指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后判斷。但常規(guī)HE染色有其局限性。約有9.0%～31.0%的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移(MM)不能被檢出[14]。因此,本文結(jié)合細(xì)胞角蛋白(CK-20、CEA)免疫組化染色的方法對(duì)獲得的淋巴結(jié)進(jìn)行檢查。在本實(shí)驗(yàn)中:常規(guī)HE染色檢查130枚中有46枚SLN存在轉(zhuǎn)移,有84枚SLN無(wú)轉(zhuǎn)移。而IHC檢查證實(shí)常規(guī)HE染色檢查SLN無(wú)轉(zhuǎn)移的84枚患者中有15枚為轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及微轉(zhuǎn)移(MM),使SLN的轉(zhuǎn)移率提升了11.5%。這其中包含1例常規(guī)HE染色nSLN陽(yáng)性而SLN陰性的患者,通過(guò)IHC染色檢查,從而減低了SLNB的假陰性率。國(guó)外近期的研究報(bào)道同樣支持了這一觀點(diǎn)[15]。本實(shí)驗(yàn)使用IHC染色檢查胃癌SLN淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)及轉(zhuǎn)移度均高于常規(guī)HE染色,但2種病理檢查結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.38,P＜0.05)。

SLN組織學(xué)狀態(tài)預(yù)測(cè)胃癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的可靠性十分重要,這也是決定SLNB能否在胃癌外科推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。準(zhǔn)確率和假陰性率是評(píng)價(jià)SLN預(yù)測(cè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況可靠性的2個(gè)重要指標(biāo)。本研究中32例患者中有31例成功檢出SLN,真陽(yáng)性為21例,真陰性為9例,由SLN組織學(xué)狀態(tài)預(yù)測(cè)胃癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的準(zhǔn)確率為96.8%(30/31);成功檢出SLN的 31例患者中,有1例呈現(xiàn)出假陰性,由SLN預(yù)測(cè)胃癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的假陰性率為4.55%(1/22),低于5%,達(dá)到了臨床上普遍可以接受的標(biāo)準(zhǔn)。

總之,通過(guò)胃癌前哨淋巴結(jié)檢測(cè)預(yù)測(cè)胃癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的方法是切實(shí)可行的。但還有許多問(wèn)題有待解決,例如規(guī)范化的染料注射,染料注射劑量,哪幾種染料聯(lián)用假陰性率最低等。本研究由于病例數(shù)較少,還有待于大規(guī)模多中心臨床隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)和對(duì)胃癌生物學(xué)特性的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),以確認(rèn)該技術(shù)在胃癌治療上的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] Cabanas RM.An approach for the treatment of penile carcinoma[J].Cancer,1977,39(2):456.

[2] Kretschmer L,Hilgers R,Mohrle M,et al.Patients with lymphatic metastasis of cutaneous malignant melanoma benefit from sentinel lymphonodectomy and early excision of their nodal disease[J].Eur JCancer,2004,40:212.

[3] Nieweg OE,Bartelink H.Implication of lymphatic mapping for staging and adjuvant treatment of patientswith breast cancer[J].Eur J Cancer,2004,40:179.

[4] 程黎陽(yáng),陳曉東,張玉新,等.專利藍(lán)和放射物聯(lián)合示蹤檢測(cè)胃癌其哨淋巴結(jié)及其臨床意義[J].中華外科雜志,2005,43(9):569.

[5] 馮虎翼,高根五.亮藍(lán)作為腋窩前哨淋巴結(jié)勘探示蹤劑的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2002,31(7):609.

[6] Veronesi U,Paganelli Q,Viale Q,et al.Sentinel lymph node biopsy and axillary dissection in breast cancer:results in a large series[J].Natl Cancer Inst,1999,91(4):368.

[7] Suga K,Yamamoto S,Tangoku A,et al.Breast sentinel lymph node navigation with three-dimensional interstitial multidetector-row computed tomographic lympho-graphy[J].Invest Radiol,2005,40(6):336.

[8] 陸云飛,陳波.乳腺癌前哨淋巴結(jié)定位切除微轉(zhuǎn)移檢測(cè)及其臨床意義[J].廣西醫(yī)學(xué),2006,28(1):25.

[9] Kitagawa Y,Ohgami M,Fujii H,et al.Laparoscopic detection of sentinellymph nodes in gastrointestinal cancer:A novel and minimally invasive approach[J].Ann Surg Oncol,2001,8(9 Supp l):86.

[10]Chen XM,Shuichi H,Gen T,et al.Tumor growth pattern and selection of treatment modality in limited growth early gastric cancer[J].Med J Kagoshima,1997,49(2):89.

[11]劉尚志,張才全.淋巴結(jié)顯像技術(shù)用于胃腸道腫瘤診斷的進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2005,34(1):137.

[12]曹其彬,陳士遠(yuǎn).胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律及其清掃范圍探討[J].山東醫(yī)藥,2004,44(36):45.

[13]付建民,劉新杰.亞甲藍(lán)染色法檢測(cè)乳腺癌哨兵淋巴結(jié)的臨床應(yīng)用[J].廣東醫(yī)學(xué),2002,2(6):73.

[14]Intetnational(Ludwig)Breast Cancer Stu-Group.Prognostic importance of occult avllars lymph node micometastases from breast cancer[J].Lancet,1990,335(5):1565.

[15]Karube T,Ochiai T,Shimada H,et al.Detection of sentinel lymph nodes in gastric cancers based on immunohistochemical analysis of micrometastases[J].Surg Oncol,2004,87(1):32.