化學發(fā)光酶免疫分析法檢測食品中赭曲霉毒素

邱云青，王 偉，李鳳琴*

(中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100021)

化學發(fā)光酶免疫分析法檢測食品中赭曲霉毒素

邱云青，王 偉，李鳳琴*

(中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100021)

目的：建立檢測食品中赭曲霉毒素(OA)快速靈敏化學發(fā)光酶免疫方法。方法：采用棋盤滴定法確定OABSA抗原的包被質(zhì)量濃度、包被量以及一抗和二抗的工作稀釋度，建立間接競爭抑制曲線，確定線性范圍、檢出限和回收率。結(jié)果：確定的檢測工作條件為：OA-BSA最佳包被質(zhì)量濃度60ng/mL，抗OA單克隆抗體的最佳工作稀釋度1:400，校正曲線線性范圍6～400ng/mL，赭曲霉毒素的檢出限為0.02ng/mL，50%抑制質(zhì)量濃度145ng/mL，在100～2000ng/g添加水平的回收率范圍為83.6%～105.8%。用所建方法對質(zhì)控樣品進行了分析，檢測結(jié)果符合率達到100%。結(jié)論：所建方法準確、靈敏，適用于食品中OA的篩選。

赭曲霉毒素；化學發(fā)光酶免疫分析；檢測

赭曲霉毒素(ochratoxin A，OA)是由曲霉屬和青霉屬的某些種產(chǎn)生，以污染小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和咖啡等農(nóng)作物為主的一種無色結(jié)晶化合物?？扇苡跇O性有機溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，對熱穩(wěn)定。動物攝入受OA污染的飼料后可引起急慢性中毒。OA主要侵害動物肝臟與腎臟，引起肝臟、腎臟損傷，大劑量時可引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。此外，OA還具有致畸作用[1]。

目前檢測糧食和食品中OA的方法有薄層色譜法(TLC)[2]、液相色譜法(LC)[3-5]、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(LC-MS-MS)[7]等。上述方法雖都有一定優(yōu)點，但尚存在不足。儀器法雖準確，但技術(shù)要求較高、所需儀器設備昂貴、樣品前處理繁瑣且對凈化結(jié)果的要求較高、不適應于現(xiàn)場檢測。普通ELISA法所需分析時間長，靈敏度不能滿足痕量檢測的要求，由此限制了方法的普及推廣[8]。而近幾年新發(fā)展的以發(fā)光氨(魯米諾)-過氧化氫-增強劑為基質(zhì)的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)系統(tǒng)[9-10]為代表的化學發(fā)光酶免疫分析法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)是免疫檢測方法中最靈敏的代表，是近十年來發(fā)展迅速的非放射性免疫分析，具有高通量檢測、靈敏度高、檢測范圍寬、分析速度快、價廉經(jīng)濟等優(yōu)點，是免疫分析的重要發(fā)展方向，并被逐漸引入食品安全領域有毒有害物質(zhì)的檢測[11-12]，與HPLC檢測結(jié)果相比差異無顯著性，但靈敏度比普通ELISA方法提高20倍[13]。本實驗旨在建立一種CLIA檢測食品中OA的靈敏方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

OA標準品、OA-BSA偶聯(lián)物、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG 美國Sigma公司；小鼠抗OA單克隆抗體(本所自制)；CL發(fā)光底物增強系統(tǒng)(魯米諾-過氧化氫-增強劑) Pierce公司； 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉(以上試劑均為化學純)、甲醇(色譜純)北京化工廠。

1.2 儀器與設備

1507520型化學發(fā)光分析儀 美國Thermo Scientific公司；BS110S型電子分析天平(感量0.001g) 北京賽多利斯科學儀器有限公司；微量可調(diào)移液器(量程1μL～1000mL) Eppendorf公司；96孔不透明聚苯乙烯微孔板美國Thermo公司；LTI-601SD型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；Allegra X-22R型離心機 美國Sigma公司；OA-SYSTMheating system氮吹儀 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液系統(tǒng)的配制

0.01mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；封閉液：含2g/100mL BSA pH7.4的0.01mol/L PBS；抗體稀釋液：含0.1g/100mL BSA pH7.4的0.01mol/L PBS；抗原稀釋液：20%甲醇-PBS(pH7.4，0.01mol/L)(V/V)；洗液：含0.05%(V/V)吐溫-20的PBS。

OA標準溶液：將OA標準粉末溶于甲醇溶液中，配成1.0mg/mL標準儲備液，檢測時，用抗原稀釋液將該標準儲備液稀釋至所需質(zhì)量濃度，4℃保存。CLIA標準曲線使用的標準溶液是將上述OA標準儲備液稀釋成800、400、200、100、20、2、0.2ng/mL標準工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2CLIA檢測OA工作條件的確定

1.3.2.1OA-BSA抗體偶聯(lián)物最佳包被量確定

經(jīng)過多次實驗，微孔板的包被量確定為100μL/孔。

1.3.2.2OA-BSA抗體偶聯(lián)物最佳包被質(zhì)量濃度及抗體最佳工作稀釋度的確定

采用棋盤滴定法確定包被抗原、抗體的最佳工作質(zhì)量濃度。將OA-BSA抗原偶聯(lián)物用0.1mol/L碳酸鹽 (pH9.6)緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度分別為50、60、70、80ng/mL的溶液包被酶標板，100μL/孔，每個質(zhì)量濃度包被1列。于4℃孵育過夜，次日用含0.05%吐溫-20的PBS洗滌3× 3min次后， 每孔加入含2g/100mL BSA的PBS封閉液120μL/孔，37℃封閉1h后，加入梯度稀釋的抗OA抗體(1:50、1:100、1:200、1:400及1:800)，50μL/孔，37℃反應2 h后， 洗滌4次。加入l:10000 HRP標記羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃反應 1h后加入CLIA發(fā)光底物增強系統(tǒng)，發(fā)光2min測定其發(fā)光強度。按照優(yōu)選法實驗設計組合配比，選擇發(fā)光最大值所對應的最低包被抗原、最大抗體稀釋度作為判定標準，優(yōu)選出OA-BSA最佳包被質(zhì)量濃度(60ng/mL)和抗OA抗體的最佳工作稀釋度為1:400。

1.3.2.3 辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG工作效價的確定

用OA-BSA抗體偶聯(lián)物(60ng/mL)包被酶標板，100μL/孔，每個質(zhì)量濃度包被1列。于4℃孵育過夜，次日用洗液洗滌3×3min次后，每孔加入2g/100mL BSA封閉液120μL，37℃封閉1h。加入抗OA抗體(稀釋度為1:400)，50μL/孔，37℃反應2h后，洗滌4次。加入梯度稀釋(1:10000、1:15000、1:20000、1:25000及1:30000，V/V) HRP標記的羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃反應1h，洗滌4次后加入發(fā)光底物并測定其發(fā)光強度。

1.3.2.4 標準曲線

酶標板經(jīng)OA-BSA偶聯(lián)物包被、封閉后，加入抗原抗體反應液(25μL OA標準工作液＋25μL 1:200的抗OA抗體)，50μL/孔，同時設陰性對照(25μL抗OA抗體＋25μL抗原稀釋液)50μL/孔，37℃反應2h后， 洗滌4次。加入l:10000 HRP標記羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃反應1h，經(jīng)洗滌4次后加入發(fā)光底物，測定其發(fā)光強度。以發(fā)光強度(B)與陰性對照發(fā)光強度(B0)比值(B/B0)為縱坐標，以OA標準溶液濃度的常用對數(shù)值為橫坐標作圖繪制標準曲線。

1.3.2.5 檢出限(LOD)和檢測范圍

根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會、國際標準協(xié)會和美國官方分析化學家協(xié)會的協(xié)調(diào)準則，用標準曲線插入法計算OA的LOD。即將6個陰性對照發(fā)光強度(B0)均值所對應的被測物質(zhì)量濃度減去其標準差(s)3倍的值，即為LOD，同時根據(jù)曲線線性區(qū)間確定線性范圍。

1.3.3CLIA檢測OA方法的建立

1.3.3.1 樣品提取

樣品粉碎后過250～500μm網(wǎng)篩。稱取5g至100mL具塞三角燒瓶中，加入20mL乙腈-水溶液(84:16，V/V)，強力振蕩3min后過濾，取4mL濾液，氮氣吹干，殘渣用20%甲醇-PBS溶解后進行檢測。

1.3.3.2 測定

用質(zhì)量濃度60ng/mL OA-BSA偶聯(lián)物包被酶標板，100μL/孔、4℃孵育過夜，次日用 0.05%吐溫-20洗滌3min(重復3次)，每孔再加2g/100mL BSA封閉液120μL/孔，37℃封閉1h。然后加入抗原抗體反應液(25μL OA樣品提取液＋25μL抗OA抗體(1:200，V/V))，50μL/孔，同時設陰性對照(25μL抗OA抗體＋25μL抗原稀釋液)，50μL/孔，37℃反應2h后，洗滌4次。加入l:10000 HRP標記羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃反應1h，洗滌4次后加入發(fā)光底物，測定其發(fā)光強度。

1.3.3.3 計算

樣品中OA含量按以下公式用標準曲線插入法計算。曲線縱坐標為待測物發(fā)光強度(B)與陰性對照發(fā)光強度(B0)之比，橫坐標為待測物中OA含量的常用對數(shù)值。

Y=aX+b

式中：Y=B/B0；X為待測物中OA含量/(ng/mL)的對數(shù)值；a為斜率；b為截距。

OA含量/(μg/kg)=C×D×X/(S×W)

式中：C為酶標板上測得的OA含量/ng，根據(jù)標準曲線插入法求得；D為樣品提取液的體積/mL；X為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；S為酶標板上每孔加入的樣液體積/mL；W為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 方法回收率

分別將一定質(zhì)量濃度的OA標準溶液加到5g粉碎后經(jīng)儀器法證明不含OA的玉米中，使其添加量分別為100、200、500、2000ng/g，按前述方法提取后進行檢測。

1.3.5 日內(nèi)與日間精密度的測定

將一定質(zhì)量濃度的OA標準溶液加到5g粉碎后玉米中，使其添加量為100ng/g，按前述方法提取后進行檢測，在同一天不同時間點以及不同天對同一樣品在相同條件下作重復提取后測定(至少3次)。

1.3.6CLIA檢測真菌毒素驗證方法檢測質(zhì)控樣品

用本實驗建立的CLIA法檢測質(zhì)控樣品(FAPAS玉米粉末樣品，其中的OA含量范圍為31～58ng/mL)中的OA含量，具體操作方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1CLIA最佳工作條件的確定

2.1.1OA -BSA包被質(zhì)量濃度和抗OA抗體的稀釋度

經(jīng)過多次實驗，微孔板的包被量確定為100μL/孔。結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，發(fā)光強度隨抗體稀釋度增加而下降，曲線拐點位于抗OA抗體稀釋度為1:400、包被質(zhì)量濃度60ng/mL處，從而確定抗原偶聯(lián)物最佳包被質(zhì)量濃度60ng/mL，抗赭曲霉毒素單克隆抗體的最佳工作稀釋度為1:400。

圖1 OA-BSA偶聯(lián)物最佳包被質(zhì)量濃度和抗OA抗體最佳工作稀釋度篩選Fig.1 Screening of the optimal OA-BSA conjugate concentration and the optimal working dilution of anti-OA antibody

2.1.2HRP標記羊抗鼠IgG工作效價的確定

經(jīng)過多次實驗，HRP標記羊抗鼠IgG的工作效價為1:10000。

2.1.3 標準曲線、檢測限和檢測范圍

經(jīng)實驗，CLIA檢測OA標準曲線的線性方程為Y= -0.234x＋1.006，LOD為0.02ng/mL(換算成樣品中的OA含量為0.4ng/g)，檢測線性范圍為6～400ng/mL，50%抑制質(zhì)量濃度為145ng/mL。

2.1.4 方法回收率

當添加到玉米中的OA添加量分別為100、200、500、2000ng/g時，方法的回收率見表1。

表1 玉米樣品中OA的回收率實驗(n=5)Table 1 Recovery experiments of OA in corn samples (n=5)

2.1.5 日內(nèi)精密度和日間精密度

表2 OA在100ng/g加標水平的日內(nèi)和日間精密度Table 2 Precision assay of OA with the spiked sample level of 100 ng/g

由表2可見，相對標準偏差小于15%，說明精密度良好。

2.2 樣品分析

本研究建立的CLIA法分析FAPAS玉米質(zhì)控樣品(OA含量31～58ng/g)，在不同日共測5次，結(jié)果見表3。由表3可知，檢測結(jié)果符合率為100%。

表3 CLIA法檢測玉米質(zhì)控樣品中OA的結(jié)果Table 3 Results of CRM detection in corn samples using the CLIA method

3 結(jié)論與討論

本實驗建立了OA的免疫化學發(fā)光檢測法，檢測限為0.02ng/mL(換算成樣品中的OA含量為0.4ng/g)，檢測線性范圍為6～400ng/mL， 50%抑制質(zhì)量濃度為145ng/mL，完全可以滿足現(xiàn)場快速、大批量檢測的需求。

在100、200、500、2000ng/g添加水平的加標回收率范圍為83.6%～105.8%。對質(zhì)控玉米樣品的檢測結(jié)果顯示，CLIA法檢測結(jié)果的重現(xiàn)性較高。國內(nèi)熊勇華等[14]建立的ELISA法檢測OA的檢測限為1ng/mL，劉仁榮等[15]建立單克隆抗體競爭ELISA法檢測OA的檢測限為0.15ng/mL，均高于本實驗所建方法的檢測限(0.02ng/mL)。因此本實驗建立檢測OA的CLIA法其靈敏度高于傳統(tǒng)的ELISA法，而精確度和準確性均能滿足實際工作需要，且與ELISA法相比檢測時間縮短，使用試劑量更少，適用于食品中OA的分析。

實驗發(fā)現(xiàn)，由于靈敏度較高，檢測時發(fā)光強度受實驗操作中各環(huán)節(jié)因素的影響較大，故本方法對實驗操作人員的操作技術(shù)有較高要求?？傊?，由于CLIA法操作更簡便，提取樣品不需要復雜的凈化過程，節(jié)省了時間和實驗材料，而且實際工作中可使用384孔微孔板，一次實驗即可檢測大量樣本，且檢測過程可利用常規(guī)設備實現(xiàn)自動化，非常適用于大面積篩選。

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Detection of Ochratoxin A in Food by Chemiluminescent Immunoassay

QIU Yun-qing，WANG Wei，LI Feng-qin*
(National Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China)

Objective: To establish a sensitive, specific and rapid chemiluminescent immunoassay (CLIA) method for the detection of ochratoxin A (OA) in food. Methods: The optimal conditions of CLIA for OA detection including the concentration of OA-bovine serum albumin (BSA) conjugate, the volume of OA-BSA solution for immobilization, the working concentrations of both antibodies against OA and a horseradish peroxidase-labeled anti-antibody, were explored by chessboard titration experiments. The linear range and the limit of detection (LOD) were studied as well. Certified reference material (CRM) of corn samples containing OA obtained from Food Analysis Performance Assessment Scheme (FAPAS) were analyzed by the developed CLIA method. Results: The optimal CLIA conditions for OA detection were 0.06μg/mL coating concentration of OA-BSA, 100μL/well of coating volume and 1:400 of working titer of the antibody against OA. The linear range of the developed CLIA was 6-400 ng/mL. The half inhibitory concentration was 145 ng/mL and the LOD was 0.04μg/kg for OA in food samples. The recovery rate was in the range of 66%-124% with the spiked sample level of 0.1-2μg/kg. CRM corn samples were analyzed and the results were consistent with the real values. Conclusion: The developed CLIA method was simple, fast, sensitive and can be employed in the screening of OA in foods．

ochratoxin A(OA)；chemiluminescent immunoassay (CLIA)；detection

Q814

A

1002-6630(2010)24-0433-04

2010-10-12

國家“863”計劃項目(2007AA10Z423)

邱云青(1973—)，女，博士研究生，研究方向為生物毒素分析與控制。E-mail：dawndew@163.com

*通信作者：李鳳琴(1963—)，女，研究員，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lifengqin0224@gmail.com