敗醬草中黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性

孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，李雪菲，劉信嘉，樸 麗

(渤海大學(xué) 遼寧省食品質(zhì)量安全與功能性食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013)

敗醬草中黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性

孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，李雪菲，劉信嘉，樸 麗

(渤海大學(xué) 遼寧省食品質(zhì)量安全與功能性食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013)

目的：探討敗醬草中黃酮的最佳提取條件及其抗氧化活性。方法：以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溫度、料液比為主要影響因素，以黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取條件，并通過對(duì)羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)、NO2的清除效果及對(duì)油脂的抗氧化研究其抗氧化活性。結(jié)果：在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間2h、溫度70℃、料液比1:20(g/mL)的條件下提取效果最好，敗醬草提取物在各抗氧化體系中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)兩種油脂均有良好的抗氧化效果，且其作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系，其抗氧化活性均強(qiáng)于VC。結(jié)論：敗醬草中含有活性較高的抗氧化成分。

敗醬草；黃酮提??；抗氧化活性

敗醬草(Herba Patriniae)，又稱澤敗、苦菜等，屬敗醬科多年生草本植物。它是我國常用中藥，具有清熱解毒之功效。野生敗醬草廣泛存在于自然界[1-2]。研究表明，敗醬草含有較高的黃酮、皂苷等活性物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，在我國的許多地方被作為野生蔬菜食用，由此可見敗醬草不僅是一種安全性較高的中藥材而且還是一種較好的天然抗氧化劑[3-4]。

目前，國內(nèi)對(duì)銀杏黃酮、紫蘇黃酮、藍(lán)莓黃酮、桑葉黃酮等的研究報(bào)道較多[5-8]，對(duì)敗醬草黃酮類化合物的研究較少。本實(shí)驗(yàn)就敗醬草黃酮的提取和抗氧化性進(jìn)行初步的試驗(yàn)研究，旨在通過幾個(gè)體外實(shí)驗(yàn)體系研究敗醬草中黃酮類化合物的抗氧化活性，以期提高敗醬草的附加值，為使敗醬草黃酮類化合物作為天然抗氧化劑和功能性食品的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敗醬草購自當(dāng)?shù)厮幍?，?jīng)陰干、粉碎后備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸、氯化亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、三氯甲烷、冰乙酸、Na2S2O3·5H2O、N-1-苯基乙二胺鹽酸鹽、對(duì)氨基苯磺酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-4802S雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 北京華旦儀器科技發(fā)展有限公司；SXT06型索氏提取儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；雙列四孔水浴鍋 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取0、2、4、6、8、10mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至于25mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至10mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，再加入5%硝酸鋁溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，加入1mol/mL氫氧化鈉溶液5.0mL，最后用30%乙醇溶液定容到刻度線，搖勻，靜置5min后，在波長510nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2 提取敗醬草中總黃酮的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化敗醬草中黃酮類物質(zhì)的提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 提取敗醬草中總黃酮正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of total flavonoids from Patrinia

1.3.3 敗醬草黃酮提取物的制備

稱取敗醬草粉末5g，加20倍體積60%乙醇溶液，于70℃恒溫水浴中加熱，時(shí)間為2h。提取物經(jīng)抽濾后定容在100mL容量瓶中。

1.3.4 敗醬草中總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[9]。準(zhǔn)確吸取0.5mL提取物，加入25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，再加入5%硝酸鋁溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，加入1mol/L氫氧化鈉溶液5.0mL，最后用30%乙醇溶液定容到刻度線，搖勻，靜置5min后，在波長510nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物總黃酮的含量。

1.3.5 對(duì)羥自由基清除作用的測(cè)定[10]

往10mL試管中依次加入2mmol/L FeCl2、2mmol/L H2O2、6mmol/L水楊酸各1mL，搖勻，于37℃水浴中反應(yīng)15min，于波長510nm處測(cè)定吸光度(A0)，再加入0.2mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取物，加水至10mL，搖勻，靜置10min，于波長510nm處測(cè)定吸光度(A1)，同時(shí)用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品作陽性對(duì)照，并計(jì)算抑制率(d1)。

1.3.6 對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的測(cè)定[11-12]

取0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入0.1mL試樣和0.4mL 2.5mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)4min，加入8mol/L HCl溶液兩滴終止反應(yīng)，于波長299nm處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照組以相同體積的蒸餾水代替樣品。同時(shí)用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品作陽性對(duì)照，并計(jì)算抑制率(d2)。

式中：A背景為每管樣品同時(shí)做一個(gè)背景對(duì)照，按樣品管同時(shí)加入相同量的樣品、緩沖液、鄰苯三酚用蒸餾水代替。

1.3.7 對(duì)亞硝酸鹽清除作用的測(cè)定[13]

取3支10mL比色管a、b、c，準(zhǔn)確吸取2mL 5μg/mL NaNO2溶液兩份，分別加入a、c管中，吸取一定量黃酮提取物，分別加入a、b管中，反應(yīng)10min后，a、b、c管中分別加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液2.0mL，搖勻，靜置5min，再都加入0.2%鹽酸萘乙二胺1mL，搖勻，靜置15min后于波長538nm處測(cè)得吸光度，同時(shí)用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品作為陽性對(duì)照。以b管為參比測(cè)得a管的吸光度，以水為參比測(cè)得c管的吸光度，并計(jì)算清除率(d3)。

式中：A0為未加提取物亞硝酸鈉的吸光度；A為加提取物后亞硝酸鈉的吸光度。

1.3.8 敗醬草提取物對(duì)豬油過氧化的抑制作用[14-16]

將黃酮提取物分別按豬油質(zhì)量的0%、1%、2%、4%、8%混入豬油中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍瑢⒁烟砑涌寡趸锏呢i油置于干燥箱中，60℃條件下加速氧化，每隔一定時(shí)間測(cè)其POV值。

POV/(meq/kg) = C(V1-V0)×1000/m

式中：V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/ mL；V0為空白實(shí)劑消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/ mL；C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/(mol/L)；m為試樣的質(zhì)量/g。

測(cè)定步驟：精確稱取3.00g混勻樣品，置于250mL碘瓶中，加入30mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，使樣品完全溶解，再加入1.00mL飽和碘化鉀溶液，緊密塞好瓶蓋，并輕輕振搖30s，然后于暗處放置3min，取出時(shí)加100mL雙蒸水搖勻，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01mol/L)滴定，至淡黃色時(shí)，加1mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。

取相同量三氯甲烷-冰乙酸溶液、碘化鉀溶液、水，按同一方法，做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.9 敗醬草提取物對(duì)菜油過氧化的抑制作用[14-16]

方法同1.3.8節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=10.143C＋0.0056，R2=0.9992。

2.2 敗醬草中總黃酮提取的正交試驗(yàn)

表2 敗醬草中總黃酮提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of total flavonoids from Patrinia

由表2可知，各因素對(duì)黃酮類物質(zhì)提取的影響由大到小分別為A＞C＞B＞D。根據(jù)正交試驗(yàn)初步確定敗醬草中黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即時(shí)間2h、溫度70℃、料液比1:20、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

2.3 敗醬草嫩葉中總黃酮含量的測(cè)定

應(yīng)用正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件提取敗醬草嫩葉中的黃酮，通過NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定其含量，根據(jù)回歸方程：A=10.143C＋0.0056計(jì)算，得到敗醬草黃酮的含量為1.78%。

2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 敗醬草提取物對(duì)羥自由基清除作用

由圖1可見，敗醬草提取物對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除作用。在相同質(zhì)量濃度條件下，敗醬草提取物與VC相比，具有更強(qiáng)的清除羥自由基的活性。在0.002～0.010mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著敗醬草黃酮質(zhì)量濃度的增加對(duì)羥自由基的清除作用加強(qiáng)，在質(zhì)量濃度0.002～0.006mg/mL范圍內(nèi)清除率的曲線較為平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.006mg/mL時(shí)，清除效果明顯增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.010mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)81.20%。

圖1 敗醬草提取物對(duì)羥自由基的清除效果Fig.1 Scavenging rates of extract with various concentrations from Patrinia on hydroxyl free radicals

2.4.2 敗醬草提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

圖2 敗醬草提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.2 Scavenging rate of extract with various concentration from Patrinia on superoxide anion free radicals

圖3 敗醬草提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除效果Fig.3 Scavenging rate of extract with various concentration from Patrinia on nitrite

2.4.3 敗醬草提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用由圖3可知，敗醬草黃酮類化合物對(duì)亞硝酸鹽具有較高的清除率，隨著敗醬草黃酮類化合物質(zhì)量濃度的增大，對(duì)亞硝酸鹽的清除作用增強(qiáng)，量效關(guān)系明顯。在同等條件下敗醬草黃酮類化合物對(duì)亞硝酸鹽的清除率明顯優(yōu)于VC。

2.4.4 敗醬草提取物對(duì)豬油過氧化的抑制作用

圖4 敗醬草提取物添加量對(duì)豬油的抗氧化效果Fig.4 Antioxidant effect of total flavonoids from Partinia on lard

通過圖4可知，在豬油中添加敗醬草黃酮提取物后，所有試驗(yàn)組的POV值均低于空白對(duì)照組，而且空白對(duì)照組的過氧化值增加明顯，而添加了提取物后其過氧化值增加較緩，這說明敗醬草黃酮提取物對(duì)豬油具有抗氧化作用。其抗氧化作用隨添加提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng)。

2.4.5 敗醬草提取物對(duì)菜籽油過氧化的抑制作用

圖5 敗醬草提取物添加量對(duì)菜籽油的抗氧化效果Fig.5 Antioxidant effect of total flavonoids from Partinia on colleseed oil

由圖5可知，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間范圍內(nèi)，同一油樣放置的時(shí)間越長，所生成的過氧化物越多，POV值就越大；未添加任何抗氧化劑(黃酮提取物)的空白對(duì)照組在0～6d內(nèi)，過氧化值變化幅度較小，在第6～9天，過氧化值顯著增加，而添加了提取物后，其過氧化值增加較少，在相同時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組的過氧化值均低于空白對(duì)照組。因此，說明敗醬草黃酮類化合物對(duì)高溫引起的油脂過氧化具有很好的抑制作用，且隨添加量的增加而增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)確定敗醬草中總黃酮的最佳提取工藝條件：提取時(shí)間2h、提取溫度70℃、料液比1:20(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

本實(shí)驗(yàn)分別就敗醬草提取物對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的清除率及對(duì)油脂的抗氧化性進(jìn)行了測(cè)定，并與VC進(jìn)行對(duì)比，得到如下結(jié)論：敗醬草中總黃酮能夠顯著清除體系中已產(chǎn)生的羥自由基和超氧陰離子自由基及抑制其再產(chǎn)生。在一定范圍內(nèi)，清除效果隨添加質(zhì)量濃度的升高而加強(qiáng)，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為0.010mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除作用最大可達(dá)81.20%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用可達(dá)93.00%，對(duì)亞硝酸鹽的清除作用達(dá)到49.54%，且其抗氧化活性均強(qiáng)于VC。通過對(duì)豬油、菜油的抗氧化實(shí)驗(yàn)，表明敗醬草黃酮對(duì)油脂有明顯的抗氧化作用，可抑制油脂的氧化酸敗。并隨添加量的增加抑制率增強(qiáng)。

可見，敗醬草中黃酮類化合物是一種很好的抗氧化劑，而且敗醬草是傳統(tǒng)的中藥材，資源豐富，開發(fā)后不會(huì)對(duì)環(huán)境造成任何破壞影響，可作為天然的抗衰老保健品、食品抗氧化劑和具有輔助療效的藥物添加劑使用，在天然抗氧化劑和醫(yī)藥保健相關(guān)領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavoniods from Patrinia

MENG Liang-yu，LAN Tao-fang，LU Jia-kun，LI Xue-fei，LIU Xin-jia，PIAO Li
(Key Laboratory of Food Quality and Safety and Functional Food of Liaoning Province, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Objective: To develop an optimal extraction processing for total flavonoids from Patrinia and determine the antioxidant activity of total flavonoids. Methods: The effects of factors including ethanol concentration, extraction time, material-liquid ratio and extraction temperature were explored by orthogonal experiments to optimize the extraction processing of total flavonoids on the basis of the evaluation of total flavonoids content. The antioxidant activity of total flavonoids was evaluated by scavenging rates on hydroxyl and superoxide anion free radicals as well as nitrite, and antioxidant effect on lard and colleseed oil. Results: The optimal extraction conditions for total flavonoids were ethanol concentration of 60%, material-liquid ratio of 1:20(g/mL), extraction time of 2 h and extraction temperature of 70 ℃. The extract from Patrinia exhibited strong scavenging capability on hydroxyl and superoxide anion free radicals and nitrite. Meanwhile, the total flavonoids from Patrinia had strong antioxidant effect on both edible oils. The antioxidant activity of total flavonoids from Patrinia was stronger than vitamin C. Conclusion: Patrinia has bioactive components with high antioxidant activity.

Patrinia；flavonoids extraction；antioxidant activity

TQ929.2

A

1002-6630(2010)24-0214-04

2010-08-11

孟良玉(1976—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称放c天然產(chǎn)物。E-mail：mengliangyu227@163.com