響應(yīng)面分析法優(yōu)化兩相溶劑系統(tǒng)提取葛花異黃酮工藝

馮維希，張永丹，韓 婷，劉 瑩，程 鋼，黃 文,*

(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢430070；3.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430078)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化兩相溶劑系統(tǒng)提取葛花異黃酮工藝

馮維希1，張永丹2，韓 婷2，劉 瑩2，程 鋼3，黃 文2,*

(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢430070；3.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430078)

以葛花為原料，正丁醇-水兩相系統(tǒng)為溶劑提取葛花總異黃酮。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，對葛花總異黃酮提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：提取時(shí)間1.30h、提取溫度70℃、正丁醇-水的配比1:1(V/V)、液固比55:1(mL/g)時(shí)，葛花總異黃酮的實(shí)際提取率為96.24%，預(yù)測值為97.50%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相符，樣品純度可達(dá)73.89%。采用響應(yīng)曲面法對葛花異黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化合理可行。

兩相溶劑系統(tǒng)；葛花；異黃酮；響應(yīng)面法；提取工藝

葛花(Flos Puerariae)又名葛條花，為豆科植物野葛[Pueraria lobata(wild) Ohwi]的干燥花蕾，在我國主要分布于云南、廣東、湖南及其臨近省區(qū)，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中最具代表性的解酒藥物，長期以來被用于緩解酒后嘔吐等癥狀[1]。葛花中的異黃酮成分是其主要活性成分之一，藥理研究表明，葛花異黃酮具有解酒保肝[2]、抗腫瘤[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、抗氧化[5]及雌激素樣作用[6]等活性。因此，對于葛花異黃酮提取工藝的研究具有重要的意義。

對于從植物原料中獲得有效成分，在Dimitrov等[7]和Boyadzhiev等[8]提出的將固液浸取與液膜分離進(jìn)行藕合的方法基礎(chǔ)上，徐化能等[9]提出了葛藤異黃酮制備過程中用有機(jī)溶劑-水組成的兩相溶劑系統(tǒng)代替常規(guī)的單相溶劑系統(tǒng)直接浸取，即浸取與液液萃取藕合的操作新模式。該方法的優(yōu)點(diǎn)為在浸取的同時(shí)進(jìn)行部分純化，簡化了工藝設(shè)備、降低了成本、減少了異黃酮在復(fù)雜操作流程中的損失。

本實(shí)驗(yàn)以葛花為原料，嘗試以正丁醇-水兩相系統(tǒng)為溶劑，采用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken模式，重點(diǎn)考察提取時(shí)間、提取溫度、溶劑比、固液比對葛花總異黃酮提取率的影響，優(yōu)化異黃酮的提取工藝參數(shù)，為葛花資源的深加工利用及葛花異黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葛花：采于湖北恩施，晾干、密封置陰涼處保存，供實(shí)驗(yàn)用。經(jīng)鑒定，葛花為豆科植物野葛的干燥花蕾。

葛根素標(biāo)品(含量大于99%) 中國藥品生物制品檢定所；正丁醇、乙醇、甲醇、石油醚(30～60℃)均為分析純。

UV-9100紫外分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司；751型石英比色皿(10mm) 江蘇金壇市億通電子有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州國華電器有限公司；EyelaN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海欣茂儀器有限公司。

互聯(lián)網(wǎng)金融是傳統(tǒng)行業(yè)與新興行業(yè)的結(jié)合，具有互聯(lián)網(wǎng)與金融兩者的特征，展現(xiàn)出高風(fēng)險(xiǎn)特點(diǎn)。而財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)本來是任何行業(yè)都需要面臨的，但是隨著互聯(lián)網(wǎng)金融的誕生，其財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)的起點(diǎn)就直接變得更高，使得許多相關(guān)企業(yè)的應(yīng)對能力無法滿足互聯(lián)網(wǎng)金融發(fā)展的需要，極易致使企業(yè)的財(cái)務(wù)預(yù)期收益、實(shí)際收益等產(chǎn)生偏差的概率，在這種環(huán)境下，互聯(lián)網(wǎng)金融的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)更多的就是缺乏對金融市場防范機(jī)制的構(gòu)建，而且由于互聯(lián)網(wǎng)的擴(kuò)散性，任何不利于互聯(lián)網(wǎng)金融市場的信息瞬間就會被擴(kuò)散到金融消費(fèi)者，極易使得整個(gè)金融市場受到影響，主要的表現(xiàn)在四個(gè)維度。

1.2 方法

1.2.1 葛花異黃酮提取工藝流程

葛花→粉碎→過篩(60目)→正丁醇-水加熱提取(同時(shí)攪拌器攪拌)→過濾→兩相分離→過濾→測定濾液中的總異黃酮含量→計(jì)算提取率

1.2.2 異黃酮含量測定

采用紫外分光光度法以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=54.236x＋0.0123，R2=0.9997。其中以總異黃酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)。

1.2.3 葛花異黃酮提取率測定

精密稱取5g葛花粉末3份，按1.2.1節(jié)方法制備樣品溶液，再各分別精密吸取1mL置于100mL量瓶中，以70%乙醇定容至刻度。以70%乙醇作空白對照，在250nm處10mm石英比色杯測定吸光度，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中異黃酮的含量。葛花粉末中異黃酮含量測定參考李文等[10]報(bào)道方法。

1.2.4 葛花總異黃酮提取的單因素試驗(yàn)

分別以不同的提取時(shí)間(20、30、60、90、120min)，提取溫度(30、40、50、60、70℃)，正丁醇-水溶劑配比(1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)及液固比[(30:1、40:1、50:1、60:1、70:1(mL/g)]為單因素，考察不同單因素對葛花異黃酮提取率的影響。

1.2.5 葛花總異黃酮提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以葛花總異黃酮提取得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 6.0.5軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)準(zhǔn)取P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

圖1 提取時(shí)間對總異黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of total isoflavones

圖2 提取溫度對總異黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of total isoflavones

圖3 正丁醇-水的溶劑配比對總異黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of n-butanol-water ratio on extraction rate of total isoflavones

圖4 液固比對總異黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total isoflavones

在單因素試驗(yàn)中，對提取時(shí)間、提取溫度、正丁醇-水的比例和液固比分別進(jìn)行考察，結(jié)果顯示：隨著提取時(shí)間的增加，葛花總異黃酮提取率也隨之提高(圖1)，但是時(shí)間超過1h后提取率的增加并不明顯，提取時(shí)間為1h較適宜。如圖2所示，隨著提取溫度升高，葛花總異黃酮的提取率明顯增加，當(dāng)溫度超過60℃葛花總異黃酮的提取率變化趨于平緩，選擇60℃為宜；改變提取溶劑比例，對總異黃酮提取率有著顯著影響(圖3)，當(dāng)正丁醇-水的比例為1:1時(shí)，總異黃酮的提取率達(dá)到最高，之后隨之下降，選擇正丁醇-水的比例為1:1。隨著提取液固比的增加，葛花總異黃酮的提取率也隨之提高(圖4)，當(dāng)液固比超過50:1時(shí)，提取率提高并不顯著，超過60:1后，提取率有所下降，因而本實(shí)驗(yàn)建議采用液固比50:1。綜上所述，選取提取時(shí)間1h、提取溫度60℃、正丁醇-水配比1:1以及液固比50:1為最佳條件。

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，優(yōu)化出29組試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及提取率的響應(yīng)值和預(yù)測值Table 2 Design of Box-Behnken experiments and response values and predicted values of extraction rate of total isoflavones

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 6.0.5軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

一般而言，探索和優(yōu)化的擬合響應(yīng)曲面可能會產(chǎn)生不好或誤導(dǎo)性的結(jié)果，除非該模型的擬合性很好，這使得檢驗(yàn)的模型基本合適。二次多項(xiàng)式的方差分析顯示該模型的P值小于0.0001(表3)，失擬項(xiàng)P=0.0545，不顯著。說明該模型擬合結(jié)果好。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of regression equation coefficients

系數(shù)的顯著性P值檢驗(yàn)見表4，如果F值越大，P值越小，相應(yīng)的變量就越顯著。參數(shù)最優(yōu)化的系數(shù)評估顯示所有的自變量和平方項(xiàng)顯著的影響總異黃酮的提取率。分析還顯示提取溫度和正丁醇-水配比的交互影響是顯著的(P＜0.0001)。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

圖6 不同浸取因素對總黃酮提取率的交互影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction among different extraction factors on extraction rate of total isoflavones

植物的各種有效成分主要存在于細(xì)胞的內(nèi)部——細(xì)胞質(zhì)中，將細(xì)胞中有效成分浸出就必須設(shè)法穿越細(xì)胞壁和膜[11]。顯然，有效成分浸出細(xì)胞壁和膜是受速度限制的。在提取效率的研究中傳質(zhì)速率的分析扮演著重要角色[12]。在本研究中隨著提取時(shí)間(X1)的延長導(dǎo)致了總異黃酮提取率的增加，當(dāng)提取時(shí)間(X1)達(dá)到某一水平(約1.25h)時(shí)，總異黃酮提取率達(dá)到最大值，此后沒有顯著進(jìn)一步的提高(圖6b)或者會有所下降(圖6a和6c)。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間太短，異黃酮分子的溶解和擴(kuò)散還沒有達(dá)到平衡，仍舊保留在葛花固體原料中；提取時(shí)間太長，溶解的異黃酮分子長時(shí)間在光、氧和微生物的環(huán)境中可能導(dǎo)致異黃酮分子的氧化、降解。

隨著液固比(X4)的增加，總異黃酮提取率將顯著增加(圖6e)，或者，當(dāng)液固比(X4)達(dá)到某一水平(約為55左右)，總異黃酮提取率達(dá)到最大值，此后沒有顯著進(jìn)一步的提高(圖6c和6f)。這可能是因?yàn)樵黾右汗瘫瓤赡茉黾恿巳軇┑皆牧霞?xì)胞的擴(kuò)散率并增加了異黃酮分子從細(xì)胞中的解吸附，當(dāng)異黃酮分子溶解充分后時(shí)，再增加液固比將不會導(dǎo)致異黃酮提取率的增加。

當(dāng)植物原料被浸泡在溶劑中，溶劑將幫助有效成分穿越細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的阻力。不同的溶劑穿越阻力的能力是依溶劑性質(zhì)來定的。不同的溶劑將具備不同的穿越能力，因此將導(dǎo)致不同的提取效果。本研究中當(dāng)提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)和液固比(X4)分別為某一固定水平時(shí)，正丁醇-水的配比(X3)變成提高總異黃酮的臨界因子，正丁醇-水的配比(X3)的波動(dòng)可能導(dǎo)致總黃酮提取率的很大不同(圖6b、6d、6f)。可以從圖中看到，正丁醇-水的配比(X3)的最佳條件約為1:1(V/V)。

提高提取溫度(X2)不僅能夠使固體顆粒膨脹破裂，產(chǎn)生裂痕或微孔，從而加深已有的破損結(jié)構(gòu)，而且能夠改變?nèi)軇┑奈锢硇再|(zhì)(表面張力、黏度等)，提高溶劑的滲透細(xì)胞壁和膜的能力。另一方面，提高溫度能夠加強(qiáng)浸取速率提高有效成分的擴(kuò)散系數(shù)。因此，在本研究中很容易發(fā)現(xiàn)，隨著提取溫度(X2)的提高，異黃酮的提取率也隨之增加(圖6a、6e)。另外研究發(fā)現(xiàn)，提取溫度(X2)在不同水平的正丁醇-水的配比(X3)，對異黃酮提取率的影響是不同的(圖6d)。從圖6d可以看到，在較低的正丁醇-水的配比(X3)水平階段，響應(yīng)曲面圖的等高線曲線相對平滑，說明提取溫度(X2)對總黃酮提取率的影響較小。然而，在高的正丁醇-水的配比(X3)水平階段，響應(yīng)曲面圖的等高線顯示提取溫度(X2)的增加對總黃酮提取率有正向影響。這可能歸因于高水平的正丁醇-水的配比(X3)有較高的黏度，只有在較高的溫度下才能降低其黏度和表面張力，溶劑才能很容易的到達(dá)活性部位。

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)預(yù)測最佳響應(yīng)值的方程(1)的可靠性，采用預(yù)測的條件進(jìn)行異黃酮的提?。簳r(shí)間1.31h，溫度69.5℃，正丁醇-水的配比1.03:1(V/V)，液固比56.42:1 (mL/g)，這時(shí)模型的預(yù)測最大值為97.50%。為了保證預(yù)測值不偏離實(shí)際值及實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：提取時(shí)間1.30h，提取溫度70℃，正丁醇-水的組成1:1(V/V)，液固比55:1(mL/g)。在此條件下重復(fù)提取3次，實(shí)際測得平均提取率為96.24%，與理論值相比，其相對誤差約為1%左右，樣品純度可達(dá)73.89%。結(jié)果分析表明實(shí)測值和預(yù)測值高度一致，同時(shí)也說明模型方程(1)是令人滿意的、準(zhǔn)確的，優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的，具有實(shí)用價(jià)值。

表5 優(yōu)化條件下的實(shí)測值與預(yù)測值Table 5 Predicted and experimental values of extraction rate under the optimal extraction processing conditions

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了正丁醇-水兩相溶劑系統(tǒng)提取葛花總異黃酮的工藝。正丁醇-水兩相溶劑系統(tǒng)的單因素試驗(yàn)表明，最佳條件為提取時(shí)間1h、提取溫度60℃、正丁醇-水配比1:1、液固比50:1。在單因素的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)曲面法對影響葛花總異黃酮提取率的主要因素(提取時(shí)間，提取溫度、正丁醇-水配比和液固比)進(jìn)行研究，以葛花總異黃酮提取率為響應(yīng)函數(shù)，建立相應(yīng)數(shù)學(xué)模型：Y = -6.69431＋21.79401X1-0.29375X2＋68.13901X3＋1.87854X4-8.26784X12-47.35284X32-0.015407X42＋0.46750X2X3。優(yōu)化了工藝條件：提取時(shí)間1.30h、提取溫度70℃、正丁醇-水的配比1:1(V/V)、液固比55:1(mL/g)，此條件下葛花總異黃酮的提取率可高達(dá)96.24%，樣品純度可達(dá)73.89%。在該優(yōu)化條件下，數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值與試驗(yàn)觀察值高度吻合，說明Box-Behnken設(shè)計(jì)法用于葛花總異黃酮的工藝優(yōu)化篩選是可行的。本實(shí)驗(yàn)為葛花資源的深加工利用及葛花異黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Optimization of Two-phase Solvent System Extraction Processing for Isoflavone from Flos puerariae by Response Surface Methodology

FENG Wei-xi1，ZHANG Yong-dan2，HAN Ting2，LIU Ying2，CHENG Gang3，HUANG Wen2,*
(1. Lianyungang TCM Branch of Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；3. College of Life Science, South Central University for Nationalities, Wuhan 430078, China)

Flos puerariae was used as raw material to extract isoflavone using n-buatnol/water two-phase system as solvents. Based on single factor experiments, the optimal extraction processing was explored by central design composite experiments combined with response surface methodology. Results showed that the optimal extraction processing parameters were extraction time of 1.3 h, extraction temperature of 70 ℃, n-buatnol-water ratio of 1:1 (V/V) and material-liquid ratio of 1:55 (g/mL). Under these optimal conditions, the extraction rate of isoflavone was 96.24%, which was very close to predicted value. Therefore, it is feasible to optimize the extraction processing of isoflavone from Flos puerariae by response surface methodology.

two-phase system；Flos puerariae；isoflavone；response surface methodology；extraction

R284.2

A

1002-6630(2010)24-0177-05

2010-06-07

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(2007009)

馮維希(1961—)，女，副教授，學(xué)士，主要從事中藥化學(xué)研究。E-mail：fengweixi@sina.com

*通信作者：黃文(1968—)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：huangwen@mail.hzau.edu.cn