向日葵盤總黃酮工藝優(yōu)化及含量測定

楊樹平，韓立軍，陳曉云，許瑞波，蔣迎道

(1.淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.淮海工學(xué)院理學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

向日葵盤總黃酮工藝優(yōu)化及含量測定

楊樹平1，韓立軍2，陳曉云1，許瑞波1，蔣迎道1

(1.淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.淮海工學(xué)院理學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

為研究向日葵盤總黃酮提取最優(yōu)條件，采用正交試驗(yàn)L9(33)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間對向日葵盤中總黃酮提取率的影響。用紫外分光光度法測定提取液中總黃酮含量，以總黃酮含量作為提取工藝優(yōu)化指標(biāo)，得出向日葵盤中總黃酮的最佳提取工藝條件為A1B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度80℃、反應(yīng)時間2h，提取效果最好，向日葵盤中總黃酮含量高達(dá)33.6436mg/g。

向日葵盤；總黃酮；工藝優(yōu)化；提取

向日葵花盤為菊科植物向日葵(Helianthus annuuss L.)的花盤，亦稱向日葵花托、向日葵餅和葵房，其性平、味甘淡、無毒、歸肝經(jīng)，主要功能有清熱平肝、止痛、止血，用于治療關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、頭暈、耳鳴、脘腹痛等[1]。向日葵盤水煎液具有治療腫瘤作用，向日葵花盤乙醇提取物有一定的降壓作用[2-3]，民間也用其作為調(diào)治萎縮性胃炎藥膳[4]。

天然黃酮作為生物活性化合物，具有預(yù)防和治療高血壓及動脈硬化、抗肝臟毒、抗炎、抗氧化、雌性激素樣、抗菌及抗病毒、瀉下作用等[5-7]，也可作為甜味劑、抗氧化劑、天然色素在保健食品、化妝品及食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[8-9]。目前，花盤中多糖、果膠和綠原酸的提取研究已有報道[10-13]，但從向日葵盤中提取黃酮類化合物還尚未見報道。內(nèi)蒙古河套地區(qū)是我國向日葵的主產(chǎn)地之一，長期以來，大量的脫去種子后的向日葵盤成為垃圾被丟棄或作為飼料使用，造成資源的極大浪費(fèi)。鑒于黃酮類化合物在醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)中的廣闊應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)通過對采自內(nèi)蒙古河套地區(qū)向日葵盤中總黃酮的提取，探討最佳提取工藝，旨在為向日葵中黃酮成分的提取提供參考，為向日葵資源的充分利用與綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

向日葵盤，采自內(nèi)蒙古自治區(qū)河套地區(qū)，秋季采摘，自然晾干，粉碎后備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、石油醚、氯仿等均為分析純。

DF-1型集熱式磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限司；UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 向日葵盤總黃酮的提取工藝

工藝流程：向日葵盤→干燥→粉碎、過篩(60目)→精密稱量→石油醚脫色→乙醇提取→過濾→定容→向日葵盤總黃酮提取液。

操作要點(diǎn)：將向日葵盤粉末(60目)在50℃恒溫烘干至質(zhì)量恒定，精密稱取粉末1g置于100mL圓底燒瓶中，加入石油醚30mL，加熱回流1h，濾去石油醚(重復(fù)操作一次)，然后揮干石油醚，按照正交試驗(yàn)表L9(33)設(shè)定的提取條件進(jìn)行提取，過濾，提取液置于100mL容量瓶中，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容，靜置待測。

1.2.2 總黃酮含量的測定

1.2.2.1 吸收波長的選擇

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱取質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.20mg，用30%乙醇將其充分溶解，并定容于200mL容量瓶中，即該標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度為0.1010mg/mL。

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和向日葵盤樣品溶液以30%乙醇為空白對照，在200～400nm波長范圍進(jìn)行紫外吸收掃描，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的最大吸收波長出現(xiàn)在260nm附近(圖1)，故選定260nm為總黃酮的測定波長。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和向日葵盤樣品(b)的紫外吸收圖譜Fig.1 UV absorption spectra of standard rutin and Helianthus annuus L.

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1、2、3、4、5mL分別置于10mL具塞試管中，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置10min后，在波長260nm處進(jìn)行紫外吸光度測定，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁含量X/(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=34.277X＋0.0304，R2=0.9998。結(jié)果表明，蘆丁對照品質(zhì)量濃度在0.0101～0.0505mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.2.2.3 樣品液制備和總黃酮含量測定

精密量取1.2.1節(jié)9組向日葵盤總黃酮提取液0.5mL分別置于10mL具塞試管中，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容，即稀釋20倍，并用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇作空白參比，按照1.2.2.2節(jié)方法通過回歸方程計算相應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度X/(mg/mL)。

總黃酮含量/(mg/g) =總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)×20 (稀釋倍數(shù))×100(提取液總體積/mL)/向日葵盤粉末質(zhì)量/g

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

分別研究固液比(g/mL)、提取時間及提取次數(shù)對向日葵盤總黃酮含量的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]并結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在選定固液比為1:25(g/mL)，提取次數(shù)2次的前提下，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計，每因素設(shè)3水平(表1)，選用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計表進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化向日葵盤總黃酮的提取工藝。

表1 向日葵盤總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵盤總黃酮提取工藝

2.1.1 不同脫色溶劑對向日葵盤總黃酮脫色效果的影響

圖2 氯仿脫色后向日葵盤樣品的紫外圖譜Fig.2 UV absorption spectrum of Helianthus annuus L. decolorized by chloroform

圖3 石油醚脫色后向日葵盤樣品的紫外圖譜Fig.3 UV absorption spectrum of Helianthus annuus L. decolorized by petroleum ether

向日葵盤中含有的脂溶性色素會影響到總黃酮提取純度并干擾含量測定的準(zhǔn)確度，分別選用石油醚和氯仿去除向日葵盤中脂溶性色素，對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，石油醚的脫脂效果明顯強(qiáng)于氯仿，見圖2、3，由于石油醚的極性弱于氯仿，更易于將向日葵盤中脂溶性成分溶出，因此其脫脂效果明顯好于氯仿。

2.1.2 固液比對總黃酮含量的影響

圖4 固液比對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the content of total flavonoids

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度70℃、提取時間2h和提取2次的條件下，研究固液比對向日葵盤總黃酮含量的影響(圖4)。結(jié)果表明，隨溶劑量的增加，總黃酮含量明顯增大，在固液比1:25(g/mL)時總黃酮的含量基本趨于穩(wěn)定。在實(shí)際操作中考慮總黃酮的充分溶出，同時也為避免溶劑的浪費(fèi)，綜合兩方面的因素，固液比設(shè)置為1:25(g/mL)時較佳。

2.1.3 提取時間對總黃酮含量的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度70℃、固液比1:25(g/mL)和提取次數(shù)2次的條件下，研究提取時間對向日葵盤總黃酮含量的影響(圖5)。結(jié)果表明，總黃酮含量隨提取時間的加大而增加，當(dāng)提取時間大于1.5h時總黃酮的含量趨于穩(wěn)定。在選擇提取時間時既要考慮到有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意過長時間的高溫提取對化合物結(jié)構(gòu)的影響，故正交試驗(yàn)設(shè)計中提取時間設(shè)置為1.5～2.0h。

2.1.4 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響

圖6 提取次數(shù)對對總黃酮含量的影響Fig.6 Effect of extraction repeat number on the content of total flavonoids

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度70℃、固液比1:25(g/mL)和提取時間2h的條件下，研究提取次數(shù)對向日葵盤總黃酮含量的影響(圖6)。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)增加，總黃酮含量增加，當(dāng)提取次數(shù)大于2次，曲線趨勢已接近平緩，即總黃酮含量的增加已不明顯，增加提取次數(shù)，可以提高總黃酮含量，從簡化實(shí)驗(yàn)操作和節(jié)省時間考慮，確定提取次數(shù)為2次。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表2 向日葵盤總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果L9(33)Table 2 Results of orthogonal experiments

表2正交試驗(yàn)結(jié)果分析表明：在影響總黃酮含量的各因素中，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)對總黃酮含量影響最大，提取溫度(B)次之，提取時間(C)影響較小，確定向日葵盤中總黃酮的最佳提取工藝組合是A1B3C3，即用50%乙醇，在溫度80℃條件下提取時間2h，可得到較高的總黃酮含量。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

精密稱取向日葵盤粗粉1g，共5份，按最佳提取工藝條件提取，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得平均總黃酮含量為33.8061mg/g，RSD1.83%，可見該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果分析得出，在固液比1:25(g/mL)，提取次數(shù)2次固定不變的條件下，向日葵盤中總黃酮的最佳提取工藝組合是A1B3C3，即用50%乙醇，在溫度80℃條件下，提取時間2h，向日葵盤中總黃酮含量為33.6436mg/g。影響向日葵盤中總黃酮含量的各因素順序依次是乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)，此提取工藝條件簡單，提取率較高，重現(xiàn)性好。

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Extraction and Determination of Total Flavonoids from Helianthus annuus L.

YANG Shu-ping1，HAN Li-jun2，CHEN Xiao-yun1，XU Rui-bo1，JIANG Ying-dao1
(1. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. School of Mathematics and Science, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

In order to investigate the optimal extraction processing conditions of total flavonoids from Helianthus annuus L, orthogonal experiments were used to explore the effects of ethanol concentration, extraction temperature and extraction time on extraction rate of total flavonoids. The content of total flavonoids was determined by ultraviolet (UV) spectrometry method. Results indicated that the optimal extraction processing conditions were ethanol concentration of 50%, extraction temperature of 80 ℃and extraction duration of 2 h. The maximum extraction rate of 33.6436 mg/g was achieved under the optimal extraction conditions.

Helianthus annuus L.；total flavonoids；optimization；extraction

R284.2

A

1002-6630(2010)24-0066-04

2010-09-20

江蘇省海洋資源開發(fā)研究院科技開放基金課題(JSIMR09D02)；淮海工學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(KX10019)；淮海工學(xué)院引進(jìn)人才啟動基金項(xiàng)目(KK01064)

楊樹平(1960—)，女，副教授，學(xué)士，主要從事藥物化學(xué)研究。E-mail：spyang69320@yahoo.cn