脂肪酶催化豬油合成L-抗壞血酸脂肪酸酯工藝條件

張 宇，呂鳳霞*，趙海珍，劉建偉，別小妹，陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院酶工程研究室，江蘇 南京 210095)

脂肪酶催化豬油合成L-抗壞血酸脂肪酸酯工藝條件

張 宇，呂鳳霞*，趙海珍，劉建偉，別小妹，陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院酶工程研究室，江蘇 南京 210095)

研究一種L-抗壞血酸脂肪酸酯酶法合成的新途徑。以廉價的豬油和L-抗壞血酸作為反應底物，探討酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的工藝條件。結果表明，在該酶促反應中，混合有機溶劑體系中底物轉化率高于相應純有機溶劑體系中的轉化率，最佳反應體系為30%叔戊醇:70%異辛烷(V/V)。研究各反應因素對轉化率的影響，確定最適反應條件為底物L-抗壞血酸與復合豬油甲酯的物質的量比為1:10、酶量10%、溫度55℃、反應時間24h，轉化率可達到(52.7±2.8)%。

脂肪酶；豬油；酶法合成；抗壞血酸脂肪酸酯

L-抗壞血酸脂肪酸酯(L-ascorbyl fatty acid esters，AFAE)是一種新型的多功能食品添加劑。由于其既含有親水性的L-抗壞血酸，又含有親油性的脂肪酸鏈，使得它兼具脂溶性抗氧化劑和食品乳化劑的特性，在食品工業(yè)中具有廣泛的用途[1-2]。

L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成主要有化學合成法[3]和酶催化合成法[4]兩類。其中化學合成法因成本低、收率高等優(yōu)點在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應用。但化學合成方法副反應多，得到的產(chǎn)品有害物質含量高，很難達到綠色食品添加劑的要求，而且該工藝還存在能耗高、對設備要求高、環(huán)境污染較為嚴重等問題。與化學合成法相比，L-抗壞血酸脂肪酸酯的酶法合成具有反應選擇性高、反應條件溫和、副反應少、轉化率高和產(chǎn)品下游分離操作相對簡單、對設備要求不高等優(yōu)點，完全符合綠色化工的發(fā)展趨勢。盡管目前酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)因酶的應用環(huán)境以及成本高的問題還沒有實現(xiàn)，但它代表了未來產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。

在酶催化法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的研究中，脂肪酶和溶劑的選擇、最佳反應條件的確定以及經(jīng)濟性底物的采用成為酶催化合成法發(fā)展的關鍵。以廉價的畜牧業(yè)加工副產(chǎn)品——豬油和L-抗壞血酸為原料，利用生物催化手段制備的L-抗壞血酸脂肪酸酯是一種混合性酯。該混合性酯既含有不飽和脂肪酸，又有飽和脂肪酸，在抗氧化的同時還具有可以提供給人體多種脂肪酸和L-抗

壞血酸的生理學效價的特性，屬于一種高效、營養(yǎng)、多功能食品添加劑，符合目前綠色食品添加劑安全、營養(yǎng)、多功能的發(fā)展趨勢。目前，有關脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的研究，國內(nèi)外尚未見報道。

本實驗探索以脂肪酶為催化劑以及豬油甲酯和L-抗壞血酸為反應底物，酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的新途徑，為研制開發(fā)新型食品添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶：固定化脂肪酶Lipozyme TL IM(T. lanuginosus)、Novozyme 435(Candida Antarctica)、Lipozyme RM IM(Rhizomucor miehei) 丹麥Novozyme酶制劑公司。游離態(tài)粉末脂肪酶FAP-15(Rhizopus oryzae)、Amnao10(Mucor javanicus) 日本Amnao酶制劑公司。

精制豬油 連云港油脂有限公司；L-抗壞血酸棕櫚酸酯標樣 德國Sigma-Aldrich公司；其他L-抗壞血酸脂肪酸酯標樣由本實驗室自制；其他試劑和有機溶劑均為分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 復合豬油甲酯的制備

取干凈的三口燒瓶，加入100g精制豬油，再加入20.6mL甲醇和0.5g NaOH，裝上回流和攪拌裝置，在反應溫度60℃，充分攪拌下反應2h。反應結束后蒸餾出過量的甲醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油。將得到的粗豬油甲酯用水洗滌數(shù)次至中性后，再用NaCl飽和水溶液洗滌一次，可得到油狀的復合豬油甲酯，備用。

1.2.2 L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成

典型反應為：0.1mmol/L L-抗壞血酸、0.2mmol/L的復合豬油甲酯加入裝有20mL反應介質的具塞三角瓶中，在反應溫度下預熱使反應物溶解并混合均勻，然后加入10%固定化脂肪酶。反應混合物在55℃旋轉水浴鍋中以180r/min的轉速反應24h。所有反應進行兩個重復，取其平均值。

1.2.3 L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC分析

取20 μL反應液進行HPLC分析。HPLC系統(tǒng)為美國Agilent公司儀器，配有UV檢測器和ZORBAX SB C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱體溫度保持在30℃，以乙腈-甲醇(1‰三氟乙酸)-水(1‰三氟乙酸)作為洗脫液，流動相流速保持在1.0mL/min，檢測器波長245nm，整個洗脫過程約45min。采用外標法進行產(chǎn)物的定量。標準L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜見圖1。

1.2.4 轉化率的測定

以反應體系中生成的L-抗壞血酸脂肪酸酯的量計算轉化率(轉化率均以L-抗壞血酸為基準進行計算)：

圖1 L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of standard AFAE

2 結果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

在酯交換反應中用于催化反應的脂肪酶類型，對于產(chǎn)物產(chǎn)率和組成而言是一個決定性因素。為了確定一種催化活性最佳的脂肪酶，按1.2.2節(jié)方法對Lipozyme TL IM、Novozyme 435、Lipozyme RM IM、FAP-15和Amnao10等脂肪酶進行篩選。結果見圖2。

圖2 脂肪酶對反應轉化率的影響Fig.2 Effect of lipase type on the conversion ratio of L-ascorbic acid

由圖2可以看出，不同脂肪酶催化的反應轉化率不同。在叔戊醇反應體系中，5種脂肪酶的催化活性從高到低依次：Novozyme 435＞Lipozyme RM IM＞Lipozyme TL IM＞Amnao10＞FAP-15。以固定化脂肪酶Novozyme 435的催化活性最高，而游離酶的催化活性比較低。這可能是因為酶固定化之后，提高了其對外界環(huán)境如溫度、pH值等的穩(wěn)定性，從而在反應體系中保持了比較高的催化活性。而游離酶由于直接同有機溶劑接觸，酶的活性位點容易受到有機溶劑破壞或改變，從而導致酶活的降低或失活?？傊捎诠潭ɑ窷ovozyme 435表現(xiàn)出了高的催化活性，因此就選用固定化酶Novozyme 435作為催化劑進行下一步的研究。

2.2 反應體系對轉化率的影響

大量的研究表明，有機溶劑作為酶反應的反應介質

會直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性[5-8]。Laane等[6]用有機溶劑的極性參數(shù)lgP來描述有機溶劑對酶反應的影響(lgP是該有機溶劑在正辛醇-水體系中的分配系數(shù)的對數(shù))。結果發(fā)現(xiàn)，lgP＜2的極性溶劑不適合作為反應介質，因為溶劑極性極強，容易奪取酶分子表面水層而使酶活性降低；lgP在2～4之間的溶劑對酶的必需水有微弱破壞，對酶活性有影響但很難預測，酶在溶劑中一般可以表現(xiàn)出中等活性；lgP＞4的非極性溶劑一般不破壞酶分子表面水層，這類溶劑是較為理想的。本實驗選擇了3種常用的有機溶劑和其混合溶劑作為反應介質，其轉化率見表1。

表1 有機溶劑對轉化率的影響Table 1 Effect of reaction medium composition on the conversion ratio of L-ascorbic acid

由表1可見，在相同的反應條件下，混合溶劑中的轉化率要高于單純?nèi)軇┲械霓D化率，這主要是因為在酶促復合脂肪酸甲酯與L-抗壞血酸合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的過程中，反應副產(chǎn)物甲醇的存在可能導致酶催化活力的下降。為了解決這個問題，需要從反應體系中除去甲醇，而極性有機溶劑如叔丁醇(lgP=0.8)已經(jīng)被用來消溶甲醇[9]。所以采用溶劑設計(solvent engineering)的方法[10]，選擇一種混合溶劑作為反應介質，這種混合溶劑由可以提供酶催化反應所需適合微環(huán)境的非極性溶劑和可以消溶甲醇的極性溶劑組成，如由叔戊醇和異辛烷混合而成的溶劑。

表2表明，叔戊醇混合溶劑中L-抗壞血酸的轉化率＞叔丁醇混合溶劑中的轉化率＞丙酮混合溶劑中的轉化率。隨著混合溶劑中極性溶劑含量的增加，反應轉化率也隨之提高。當?shù)竭_一定值后又隨之降低，這可能是因為極性溶劑消溶甲醇的能力已經(jīng)達到極限，甲醇重新開始影響酶催化活性。這一趨勢在不同混合溶劑體系中都是一致的。然而，在相同溶劑比例的情況下，同一溶劑中加入不同的極性溶劑并沒有使酯交換反應產(chǎn)生相同的反應轉化率。例如，在溶劑比例為3:7，丙酮和異辛烷的混合溶劑中反應轉化率為17.8%，而異辛烷和叔戊醇的混合溶劑中轉化率為35.6%。這可能是由于不同的極性溶劑對甲醇的消溶能力不同。

表2 在不同混合溶劑介質中酶催化L-抗壞血酸與豬油甲酯的酯交換反應Table 2 Effect of reaction medium polarity on the conversion ratio of L-ascorbic acid

2.3 酶量對L-抗壞血酸轉化率的影響

在酶催化反應中，酶量對于反應進程的快慢有著決定性影響。在本實驗中，脂肪酶固體顆粒直接懸浮于有機溶劑中，酶的加入量對于反應進行的程度有相當大的影響。酶量上升增加接觸面積，促使酶促反應加快，縮短反應時間。隨著反應時間延長酶活性降低，增大酶量保證反應能最大化。酶量對于L-抗壞血酸轉化率的影響見圖3。

圖3 酶量對L-抗壞血酸轉化率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the conversion ratio of L-ascorbic acid

從圖3可知，在反應體系中，當酶量為5%時，L-抗壞血酸轉化率比較低，但是隨著酶量的繼續(xù)增大，L-

抗壞血酸轉化率明顯提高，當酶量超過15%時L-抗壞血酸轉化率變化逐漸趨于穩(wěn)定。不斷提高反應體系中的酶量可以加快酯交換反應的進程，但與此同時逆反應進程也相應加快。另外，過高的酶量還會帶入體系過多的水分，增加水解副反應的發(fā)生。因此，過高的酶量并不一定有利于產(chǎn)物產(chǎn)量的提高，而應該從各個方面考慮來選擇合適的酶量。

2.4 底物比率對L-抗壞血酸轉化率的影響

脂肪酶催化的L-抗壞血酸和復合豬油甲酯的酯交換反應生是一種可逆反應。反應物過量或者在反應中不斷除去某反應產(chǎn)物，可使反應向正方向進行。當L-抗壞血酸達到飽和時，溶劑中存在的過量的沒有溶解的L-抗壞血酸會阻礙傳質，使L-抗壞血酸轉化率降低，造成L-抗壞血酸的浪費[11]。同時由于L-抗壞血酸易氧化和發(fā)生其他副反應，用量過多也會引起副反應的增加。

圖4 底物物質的量比對L-抗壞血酸轉化率的影響Fig.4 Effect of L-ascorbic acid/lard methyl ester molar ratio on the conversion ratio of L-ascorbic acid

保持L-抗壞血酸的量不變(0.1mmol/L)，改變復合豬油甲酯的量(0.2～1.4mmol/L)，以最佳的底物比率獲得最大L-抗壞血酸轉化率。由圖4可以看出，隨著底物含量的提高，L-抗壞血酸的轉化率也在增加，當?shù)孜锉嚷市∮?0時，轉化率升高較快。隨著底物比率的繼續(xù)提高，L-抗壞血酸的轉化率并沒有表現(xiàn)出明顯的提高。原因可能有以下幾個方面：在比較高的底物比率下，所有酶分子己經(jīng)有效地與底物結合，酶已經(jīng)飽和，即使進一步加入底物，提高底物比率對酶的催化速度也不再有影響[12]；高濃度的復合豬油甲酯不能完全溶入混和溶劑體系，提高了反應體系的黏度，增加了反應體系的傳質阻力；酶活降低或酶部分失活，這主要是由于復合豬油甲酯中可能含有未處理干凈的游離脂肪酸，而高濃度的游離酸使酶分子周圍水相酸化或使酶表層結合水被剝奪，使酶催化微環(huán)境或酶的空間構象發(fā)生改變[13]。

2.5 反應時間對L-抗壞血酸轉化率的影響

反應時間對L-抗壞血酸轉化率也是一個重要的影響因素。通過不同反應時間2、4、6、12、24、36、48h對脂肪酶Novozyme 435催化活性的變化情況，結果見圖5。

圖5 反應時間對L-抗壞血酸轉化率的影響Fig.5 Effect of reaction time on the conversion ratio of L-ascorbic acid

由圖5可以看出，開始反應的前24h內(nèi)，雖然L-抗壞血酸轉化率都比較低，但是變化非常明顯，即酶促反應速度非常快。當反應進行到2h時，L-抗壞血酸轉化率是13.6%，但當反應進行到24h時，L-抗壞血酸轉化率已達到了51.3%，相當于2h時的3.8倍。隨后，隨著反應時間的延長，L-抗壞血酸轉化率變化不再明顯，呈現(xiàn)一種漸近趨勢。研究結果表明，反應進行到24h時已處于平衡狀態(tài)，繼續(xù)延長反應時間對提高L-抗壞血酸轉化率己不再有意義。當然，反應到達平衡態(tài)所需時間的長短還與反應溫度有關。反應溫度越高，酶催化速率越快，所需反應時間就越短；反之，則越長。

2.6 反應溫度對L-抗壞血酸轉化率的影響

圖6 反應溫度對L-抗壞血酸轉化率的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on the conversion ratio of L-ascorbic acid

在有機溶劑中固定化酶具有較高的熱穩(wěn)定性，其在有機溶劑中的最適溫度比水中的要高，當溫度升高時酶反應的速度增加；但是當溫度繼續(xù)升高，酶分子的變性失活速度也會增加。為確定復合豬油甲酯與L-抗壞血酸酯交換反應中Novozyme 435的最佳溫度范圍，在45～80℃之間研究反應溫度對L-抗壞血酸轉化率的影響，結果如圖6所示。

由圖6可以看出，在反應體系中，當反應在45～65℃之間進行時，L-抗壞血酸轉化率轉化率沒有明顯改變，但當反應溫度高于65℃時，轉化率明顯降低。這種現(xiàn)象可以通過化學反應動力學Arrehenius方程來解釋：

式中：K為酶反應速率常數(shù)；A為阿侖尼烏斯常數(shù)；E為酶催化反應所需活化能；T為反應溫度；R為氣體常數(shù)。由方程可以看出，隨著反應溫度的升高，酶催化反應速率加快。同時這一方程也可以用來描述酶失活動力學，失活速率常數(shù)可表示為公式：

式中：Kd為酶動力學失活速率常數(shù)；Ad為阿侖尼烏斯常數(shù)；Ed為酶失活反應活化能；T為反應溫度；R為氣體常數(shù)。公式表明，隨著反應溫度的升高，酶失活速率也加快。

對于本研究而言，由于溫度對L-抗壞血酸的穩(wěn)定性影響較大，要避免過高反應溫度，故選擇比較低的55℃作為反應體系中的最適反應溫度。

2.7 酶的穩(wěn)定性

固定化酶的使用壽命是決定工業(yè)化過程生產(chǎn)成本的一個重要影響因素。在最佳條件下，使用Novozyme 435連續(xù)反應9個批次，結果如圖7所示。

圖7 酶的穩(wěn)定性Fig.7 Effect of repeated use of Novozyme 435 lipase on the conversion ratio of L-ascorbic acid

從圖7可以看出，連續(xù)反應9個批次后轉化率仍可達到47%以上，說明該固定化酶在此反應體系中穩(wěn)定，可以通過多次使用來降低成本。

3 討論與結論

目前國內(nèi)外生產(chǎn)的L-抗壞血酸脂肪酸酯產(chǎn)品主要是化學合成的L-抗壞血酸棕櫚酸酯。由于酶法生產(chǎn)L-抗壞血酸脂肪酸酯具有反應條件溫和、環(huán)境污染小、選擇性高等諸多優(yōu)點，已成為研究的熱點之一。湯魯宏等[14]以脂肪酶Novozyme 435為催化劑，叔戊醇為介質，在轉速200r/min、溫度55℃、水分含量0、酶量12.5%的條件下催化L-抗壞血酸和棕櫚酸或棕櫚酸甲酯合成了L-抗壞血酸棕櫚酸酯；孫燕等[15]在底物棕櫚酸甲酯與L-抗壞血酸的摩爾比1.3:1.0、反應溫度36℃、反應時間24h、脂肪酶濃度15%、含水量1%的條件下，以黑曲霉脂肪酶為催化劑獲得VC的轉化率為23%。Humeau等[4]以棕櫚酸為反應底物，在叔戊醇反應體系中使用Novozyme 435催化合成了L-抗壞血酸棕櫚酸酯，反應轉化率為68%；Song等[16]以亞油酸為底物催化合成了L-抗壞血酸亞油酸酯，反應轉化率為33.5%；Chang等[17]采用RSM優(yōu)化的方法，以月桂酸為反應底物，得到了高達93%的底物轉化率。以上所有的研究報道都集中于利用脂肪酶催化L-抗壞血酸與脂肪酸或脂肪酸甲酯/乙酯直接酯化或轉酯化反應合成L-抗壞血酸脂肪酸酯，都是采用單一脂肪酸或其甲酯/乙酯作為底物來源，而這些物質的價格都比較高，尤其是多不飽和脂肪酸。

與已報道的研究相比，本研究采用天然動物油脂——豬油首先得到復合豬油甲酯，然后利用脂肪酶催化反應合成L-抗壞血酸脂肪酸酯，并采用溶劑設計的方法解決了反應副產(chǎn)物甲醇對脂肪酶催化活性的抑制，得到了較高的L-抗壞血酸轉化率。最佳反應條件是固定化酶Novozyme 435作為催化劑、反應介質為30%叔戊醇:70%異辛烷、酶用量10%、底物L-抗壞血酸與復合豬油甲酯的摩爾比1:10、反應溫度55℃、反應時間24h。在此條件下，轉化率可達到(52.7±2.8)%，與Humeau等[4]研究結果相近。由于豬油含有多種不飽和脂肪酸，其中油酸含量為43.2%，不穩(wěn)定的雙鍵結構可能會對酶的催化產(chǎn)生不利的影響，降低了底物轉化率。這一現(xiàn)象與Song等[16]的報道相符，其原因還有待于進一步研究。

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Lipase-catalytic Synthesis of L-Ascorbyl Fatty Acid Esters in Mixed Organic Media

A novel way for the synthesis of L-ascorbyl fatty acid esters (AFAE) from low-cost lard and L-ascorbic acid under the catalysis of lipase was developed and the optimal reaction conditions were investigated. It was found that a higher substrate conversion ratio was obtained in single organic solvents than in their pairwise combinations and the optimal solvent system consisted of t-pentanol and isooctane (30:70, V/V). The optimal reaction conditions for maximum substrate conversion ratio were as follows: L-ascorbic acid/lard methyl ester molar ratio 1:10; enzyme amount 10%; and reaction temperature 55 ℃ for a reaction duration of 24 h. The conversion ratio of L-ascorbic acid under these reaction conditions reached up to (52.7±2.8)%.

lipase；lard；enzymatic synthesis；L-ascorbyl fatty acid esters

TS201.1；TQ466.3

A

1002-6630(2010)18-0134-05

2010-05-11

國家“863”計劃項目(2007AA100401；2008AA10Z309)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2008308)

張宇(1983—)，男，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：zhangyu1983323@yahoo.cn

*通信作者：呂鳳霞(1963—)，女，副教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@163.com