抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體的表達(dá)載體的比較

楊 煉，劉自琴，劉 蓉，陳海琴，陳 衛(wèi)，張 灝*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體的表達(dá)載體的比較

楊 煉，劉自琴，劉 蓉，陳海琴，陳 衛(wèi)，張 灝*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

目的：比較4種不同的pET載體在表達(dá)抗黃曲霉毒素B1(AFB1)的單鏈抗體(scFv)克隆的特點(diǎn)，確定用以表達(dá)scFv-H4的合適載體。方法：將目的基因H4分別克隆到載體pET20b、pET22b、pET28a和pET32a上，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)或Origami(DE3)中，比較誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的生長狀況和誘導(dǎo)結(jié)束后細(xì)胞破碎液中scFv-H4的生物活性以及細(xì)胞各部分包涵體。結(jié)果：pET20b和pET22b能表達(dá)具有生物活性的scFv-H4，這些具有生物活性的蛋白主要存在于周質(zhì)中；pET28a和pET32a不能表達(dá)有生物活性的scFv-H4，而pET32a僅能在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生大量的包涵體。結(jié)論：pET22b可能是表達(dá)AFB1的單鏈抗體較優(yōu)的表達(dá)載體。

黃曲霉毒素；單鏈抗體；表達(dá)；大腸桿菌；p E T

農(nóng)產(chǎn)品常常受到產(chǎn)毒素的霉菌污染，真菌毒素是霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。在這些真菌毒素中，黃曲霉毒素最具有致癌性[1]。除色譜分析法外，免疫學(xué)分析方法能高通量、高靈敏、高特異性地分析食品和飼料中的黃曲霉毒素的污染[2]。免疫學(xué)方法的建立非常依賴于高親和力、高特異性的抗體。

繼多克隆抗體制備技術(shù)和單克隆抗體制備技術(shù)之后，重組抗體技術(shù)無需免疫動(dòng)物，能夠低成本地大量制造抗體，而且能很容易地控制抗體的親和力和特異性?，F(xiàn)在有許多重組抗體已經(jīng)成功的應(yīng)用在食品科學(xué)研究和食品工業(yè)中，比如莠去津[3]、小麥蛋白[4]和核盤菌[5]等的檢測。

在這樣的研究中需要大量制備片段，而抗體片段的表達(dá)水平嚴(yán)重限制了對(duì)抗體片段的研究[6]。為解決表達(dá)問題，人們嘗試了多種表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)抗體片段的基因，比如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)[7-9]、酵母表達(dá)系統(tǒng)[10-11]、植物表達(dá)系統(tǒng)[12-13]、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞[14]。Miller等[15]比較了釀酒酵母、畢赤酵母和大腸桿菌表達(dá)抗體片段的效率和穩(wěn)定性，認(rèn)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能最快速、最穩(wěn)定的表達(dá)單鏈抗體，也有利于后續(xù)的純化操作。在前期工作中，從Tomlinson I+J人源單鏈抗體文庫中篩選到了一個(gè)高親和力的抗黃曲霉毒素B1的抗體克隆[16]；在

此研究基礎(chǔ)上，擬用大腸桿菌來表達(dá)這個(gè)克隆?；赥7啟動(dòng)子的pET表達(dá)系統(tǒng)是目前最為常用的表達(dá)異源蛋白的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[17]，而該表達(dá)系統(tǒng)有多種載體以適應(yīng)不同性質(zhì)蛋白的要求，本實(shí)驗(yàn)擬研究不同的pET載體(pET20b、pET22b、pET28a、 pET32a)表達(dá)抗黃曲霉毒素B1的單鏈抗體(scFv-H4)的特點(diǎn)，為scFv-H4的表達(dá)選擇合適的載體。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

抗黃曲霉毒素B1的單鏈抗體H4(GenBank 登錄號(hào)1176324)從Tomlinson I+J單鏈抗體文庫 (Geneservice Ltd.，英國劍橋)篩得[16]。E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli Origami(DE3)由Novagen公司(北京)提供。

黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白復(fù)合物(AFB1-BSA)、黃曲霉毒素B1(AFB1) Sigma公司(上海)的生化級(jí)試劑；蛋白A-辣根過氧化氫酶復(fù)合物(protein A-HRP)、鎳離子親和樹脂 GE Healthcare公司(上海)；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、氨芐青霉素(amp)、卡那霉素 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 Oxoids公司(上海)；DNA聚合酶 Promega公司(北京)；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶 NEB公司(北京)；其他試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、10g NaCl溶于1000mL去離子水；LB平板培養(yǎng)基：瓊脂粉10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、10g NaCl溶于1000mL去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

2MK4洗板機(jī)和Multiscan MK3酶標(biāo)儀 熱電(上海)有限公司；UV2100型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；PowerPac型電泳儀和GelDoc XR型凝膠成像系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(南京)有限公司：Sonics超聲波破碎儀 Vibracell公司。

1.3 scFv-H4基因的克隆

將含有H4基因的pIT2噬菌粒通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得H4基因，引物為：CAG GAA ACA GCT ATG AC和 CTA TGC GGC CCC ATT CA。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳純化和膠回收后，在37℃，用限制性內(nèi)切酶NcoI和NotI雙酶切H4基因與載體pET。再經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化和膠回收后，用T4連接酶將內(nèi)切酶酶切后的目的基因和載體在16℃連接24h。

取連接產(chǎn)物10μL，熱激轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli DH5α，將該E.coli DH5α涂布于LB平板培養(yǎng)基(含amp)。20h后，挑取單克隆用LB培養(yǎng)基(含amp)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶NcoI和NotI酶切驗(yàn)證，另測序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)驗(yàn)證。然后將成功構(gòu)建的pET/4H轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli BL21(DE3)或E.coli Origmi (DE3)中，在含有amp抗性的LB平板培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，挑取單克隆，并用LB培養(yǎng)基(含amp)培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后NcoI和NotI雙酶切驗(yàn)證，將甘油加入剩余的菌液中至終體積分?jǐn)?shù)為8%，分裝于－20℃凍存。

1.4 大腸桿菌的培養(yǎng)與scFv-H4的誘導(dǎo)表達(dá)

將凍存的菌株接入5mL LB培養(yǎng)基(含amp)中，37℃、200r/min振搖活化至培養(yǎng)物在波長600nm處光密度值(OD600nm)為0.5左右。取活化后的菌液2mL加入100mL LB培養(yǎng)基(含amp)中、37℃、200r/min振搖培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8后，加入誘導(dǎo)物IPTG(終濃度為1mmol/L)，再在20℃繼續(xù)誘導(dǎo)20h。在E.coli Origami(DE3)的培養(yǎng)和誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)基中加入50μg/mL的卡那霉素維持菌體的突變型。取培養(yǎng)液1mL用水稀釋10倍，測OD600nm值，菌體生物量以O(shè)D600nm值表示。

1.5 各部分蛋白的提取

取1.4節(jié)獲得的發(fā)酵物1mL，在11600×g離心15min，所得菌體沉淀用100μL，2×上樣緩沖液溶解，用以分析全細(xì)胞蛋白。

培養(yǎng)基上清液：取40mL培養(yǎng)物，14000×g離心，富集菌體；上清液用三氯乙酸濃縮10倍后用于電泳分析。

細(xì)胞周質(zhì)組分：將富集的菌體重懸于1 0 m L 20g/100mL的蔗糖溶液(pH8.0，30mmol/L的Tris-HCl緩沖液)中，加入20μL 0.5mol/L E DTA，室溫緩慢振蕩10min，10000×g 4℃離心收集細(xì)胞，棄上清液。將處理后的細(xì)胞重懸于10mL冰凍的5mmol/L MgSO4溶液，在冰上緩慢振蕩10min，此時(shí)細(xì)胞周質(zhì)蛋白被釋放到緩沖液中。4℃、11600×g離心收集細(xì)胞，上清液用三氯乙酸濃縮10倍后用于電泳分析。

細(xì)胞質(zhì)可溶組分：提取細(xì)胞周質(zhì)蛋白后的細(xì)胞沉淀用10mL PB S重懸，冰浴上超聲(200W，1s工作，9s間歇)1h后，4℃、10000×g離心，上清液用于電泳分析。

取超聲破碎液1mL于一個(gè)干凈的EP管中，11600×g離心15min后，用1mL含2g/100mL曲拉通的PBS洗滌，沉淀3次，再11600×g離心15min，沉淀用100μL 2×上樣緩沖液溶解，用以分析包涵體。

1.6 scFv-H4的純化

取誘導(dǎo)結(jié)束后的發(fā)酵物100mL，3300×g離心15min后收集菌體沉淀，用10mL的PBS重懸菌體。重懸的菌體用超聲波破碎儀在200W(1s工作，9s間歇)超聲60個(gè)循環(huán)，將超聲破碎液11600×g離心15min。

菌體破碎液離心后的上清液加入螯合有NiSO4的Sepharose Fast Flow凝膠上，用50mmol/L的咪唑溶液(含0.5mol/L NaCl，pH7.7)洗去雜蛋白后，用10mL

200mmol/L的咪唑溶液(含0.5mol/L NaCl，pH7.7)將目標(biāo)蛋白洗脫。取50μL洗脫液與50μL 2×上樣緩沖液混合，以分析蛋白純度。

1.7 SDS-PAGE凝膠電泳

取5μL樣品(按1.5節(jié)制備)在12%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，80V濃縮25min，再150V分離60～80min。用考馬斯亮藍(lán)染色和醋酸-乙醇溶液脫色，在凝膠成像系統(tǒng)上分析蛋白分布與質(zhì)量濃度。

1.8 ELISA檢測

25μL、0.33μg/mL的AFB1-BSA平鋪于酶標(biāo)板孔底(Costar 25 92)，在37℃包被2h，用PBS洗滌兩次后，用2g/100mL的BSA溶液封閉酶標(biāo)板，37℃溫浴2h，再用PBS洗滌兩次。將待測樣液50μL與100μL 2g/100mL BSA溶液一起加入酶標(biāo)板，37℃溫浴1h，用含有0.1 g/100mL 吐溫-20的PBS(PBST)洗板5次，加入含蛋白A-HRP(體積分?jǐn)?shù)0.02%)2g/100mL的BSA 溶液100μL，再在37℃溫浴1h，用PBST洗板5次。加入含H2O2(體積分?jǐn)?shù)0.006%)和TMB(100μg/mL)的醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)100μL，室溫下反應(yīng)15min后，用50μL、1mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm值和OD650nm值，ELISA的信號(hào)值為OD450nm－OD650nm。

在競爭ELISA檢測中，50μL純化后的抗體，100μL 2g/100mL的BSA和不同質(zhì)量濃度(0～2ng/mL)的黃曲霉毒素B1混合，37℃溫浴1h，取100μL混合液加入上述包被并封閉好的96孔板，ELISA剩余過程如上所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)蛋白分析與載體選擇

將scFv-H4基因序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后，發(fā)現(xiàn)scFv-H4中有4個(gè)半胱氨酸。重鏈部分含有兩個(gè)半胱氨酸，分別位于可變區(qū)的第一框架區(qū)和第三框架區(qū)，形成連接上下兩個(gè)反平行的β-片層的二硫鍵，而輕鏈部分也含有兩個(gè)半胱氨酸，分別位于可變區(qū)的第一框架區(qū)和第三框架區(qū)，也形成二硫鍵以連接上下兩個(gè)反平行的β-片層。這兩個(gè)保守的二硫鍵的形成對(duì)維持scFv-H4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的正確構(gòu)象具有重要意義。重組蛋白在細(xì)菌菌體中的大量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致外源蛋白來不及正確折疊，形成不可溶的包涵體，蛋白包涵體一般都沒有生物活性；一般大腸桿菌的還原性細(xì)胞質(zhì)不利巰基氧化成二硫鍵，所以含二硫鍵的蛋白質(zhì)形成包涵體的概率很大。經(jīng)Wilkinson- Harrison模型預(yù)測[18]，當(dāng)scFv-H4在大腸桿菌中過量表達(dá)時(shí)，scFv-H4有高達(dá)96.5%的傾向以不溶的狀態(tài)聚集，形成包涵體。為了今后研究的方便，希望scFv-H4以生物活性的形式表達(dá)。

對(duì)于具有二硫鍵的蛋白來說，如何使重組蛋白中二硫鍵正確形成是表達(dá)有生物活性的抗體片段的關(guān)鍵。要使scFv-H4形成正確的二硫鍵有兩種策略：一是將scFv-H4轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中，周質(zhì)中的氧化性環(huán)境有利于二硫鍵的形成；二是讓scFv-H4與能夠增加蛋白溶解性的標(biāo)簽融合，這些融合標(biāo)簽是高度可溶的多肽，可以增加目標(biāo)蛋白的溶解性，進(jìn)而促進(jìn)二硫鍵的形成。

針對(duì)以上兩種策略，本實(shí)驗(yàn)采用4種p E T載體(pET20b、pET22b、pET28a、pET32a)來表達(dá)scFv-H4。這4種載體有著諸多不同，比如啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記和其他載體元件(表1)。pET20b上的多克隆位點(diǎn)的N端有一個(gè)pelB信號(hào)肽序列，用以引導(dǎo)目標(biāo)蛋白穿過細(xì)胞內(nèi)膜，分泌到周質(zhì)空間中，啟動(dòng)子為T7。pET22b的多克隆位點(diǎn)的N端也有一個(gè)pelB信號(hào)肽序列，但其啟動(dòng)子為T7lac，比T7啟動(dòng)子能更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乜刂颇繕?biāo)蛋白的表達(dá)，降低目標(biāo)蛋白在沒有誘導(dǎo)劑存在時(shí)的本地表達(dá)。pET28a載體不含pelB信號(hào)肽，所表達(dá)的產(chǎn)物主要在細(xì)胞質(zhì)中積累。pET32a在多克隆位點(diǎn)的N端有一個(gè)109個(gè)氨基酸殘基的硫氧還原蛋白基因，能夠增加蛋白的溶解性，也可以在trxB突變宿主菌的細(xì)胞質(zhì)中催化二硫鍵的形成。

表1 4種pET載體的比較Table 1 Comparison of four vectors for scFv-H4 expression

2.2 用不同的載體表達(dá)scFv-H4

根據(jù)scFv-H4的蛋白序列估算scFv-H4的分子質(zhì)量大小為29kD，加上信號(hào)肽等，最終由大腸桿菌表達(dá)的蛋白分子質(zhì)量大小應(yīng)為31kD左右，由圖1A可見，純化后的scFv-H4約為31kD。比較含pET20b/H4和pET22b/ H4的E.coli BL21(DE3)的未誘導(dǎo)的細(xì)胞總蛋白(TCP)發(fā)現(xiàn)，未誘導(dǎo)的TCP明顯多于誘導(dǎo)后的TCP，這與圖1B中的菌體生物量在未誘導(dǎo)的條件下也明顯高于誘導(dǎo)條件下的現(xiàn)象一致；誘導(dǎo)后的TCP在31kD處有明顯的增強(qiáng)條帶，該條帶應(yīng)該是由誘導(dǎo)產(chǎn)生的scFv-H4。圖1B中的ELISA信號(hào)能反映scFv-H4的生物活性，也可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后菌體破碎液中ELISA信號(hào)大大高于未誘導(dǎo)的菌體破碎液。而在用pET28a表達(dá)scFv-H4的實(shí)驗(yàn)中，無論誘導(dǎo)與否，菌體的生物量、TCP和ELISA結(jié)果都差別不大，說明pET28a不能夠用以表達(dá)scFv。在采用pET32a作為載體的實(shí)驗(yàn)中，scFv-H4與硫氧還原蛋白(Trx)形成融合蛋白表達(dá)，分子質(zhì)量大小約為44kD。比較含有pET32a/H4的E.coli BL21(DE3)在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)情況下的TCP可以發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的TCP比未誘導(dǎo)的情況下

明顯減少，這一點(diǎn)也可以通過檢驗(yàn)培養(yǎng)物的生物量來驗(yàn)證(圖1B)；而在IPTG的誘導(dǎo)下，44kD附近有明顯的條帶產(chǎn)生，這就是scFv-H4-Trx融合蛋白。但圖1B中顯示含pET32a的經(jīng)誘導(dǎo)后E.coli BL21(DE3)菌體破碎液沒有明顯生物活性，所以該融合蛋白可能是以包涵體的形式存在。下一步將pET32a在細(xì)胞質(zhì)呈氧化性的E.coli Origami(DE3)中表達(dá)scFv-H4。

圖2 在E.coliOrigami (DE3)中，用pET32a表達(dá)scFv-H4時(shí)的TCP和包涵體Fig.2 TCP profile and inclusion body of scFv-H4 expressed with pET32a vector inE. coliOrigami (DE3)

圖1 用不同的pET載體表達(dá)scFv-H4Fig.1 Expression of scFv-H4 inE. coliBL21(DE3) using different pET vectors

2.3 在E.coli Origami(DE3)中，pET32a也不能表達(dá)有生物活性的scFv-H4

用pET32a在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)scFv-H4時(shí)，scFv-H4也沒有生物活性，但有大量融合蛋白的包涵體產(chǎn)生。大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中存在硫氧蛋白還原酶(trxB)和谷胱甘肽還原酶(gor)，保持了細(xì)胞質(zhì)環(huán)境的還原性，所以scFv-H4中的半胱氨酸以巰基的形式存在，不能維持scFv-H4中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的正確構(gòu)象，可能導(dǎo)致scFv-H4沒有生物活性。而E.coli Origami(DE3)是硫氧蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶突變體，這進(jìn)一步增強(qiáng)了二硫鍵的形成。然而在E.coli Orig ami(DE3)中，pET32a表達(dá)scFv-H4的結(jié)果也不是很理想。

由圖2可見，E.coli Origami(DE3)經(jīng)過誘導(dǎo)后也大量表達(dá)了scFv-H4-Trx融合蛋白(第1、2泳道)，而這些融合蛋白絕大多數(shù)是以包涵體的形式存在(第3、4道)，而ELISA實(shí)驗(yàn)信號(hào)為0.062±0.007(空白為0.048±0.004)。這說明在E.coli Origami(DE3)細(xì)胞破碎液中沒有明顯的scFv-H4生物活性。由此可見，細(xì)胞的氧化還原勢不是唯一決定scFv-H4正確折疊的因素，其他的因素比如分子伴侶可能也決定著scFv-H4的正確折疊。

2.4 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯?dòng)子有利于scFv-H4的表達(dá)

從2.2節(jié)的結(jié)果可以看出在E.coli BL21(DE3)宿主中，具有信號(hào)肽的載體pET20b和pET22b所表達(dá)的scFv-H4是有生物活性的。但是E.coli BL21(DE3)/pET20b/H4的菌體破碎液中的生物活性低于E.coli BL21(DE3)/pET22b/H4的菌體破碎液中的生物活性。pET20b和pET22b的載體的主要區(qū)別在于啟動(dòng)子，pET22b由T7lac啟動(dòng)，比pET20b的T7更加嚴(yán)格。從E. coli BL21(DE3)/pET20b/H4和E.coli BL21(DE3)/pET22b/H4培養(yǎng)的生長曲線(圖3A)和誘導(dǎo)過程中具有生物活性的scFv-H4的表達(dá)情況(圖3B)可以發(fā)現(xiàn)它們之間的區(qū)別。在尚未添加IPTG的時(shí)候，E.coli BL21(DE3)/pET20b/H4菌體破碎液已經(jīng)能檢測到一定水平的scFv-H4生物活性，但E.coli BL21(DE3)/ pET22b/H4菌體破碎液并無明顯的scFv-H4生物活性被檢測到；添加了IPTG后，E.coli BL21(DE3)/pET20b/H4菌體破碎液scFv-H4生物活性有所上升，但上升的速度較慢，而E.coli BL21(DE3)/pET22b/H4在IPTG的誘導(dǎo)后菌體破碎液中scFv-H4生物活性快速上升。

T7啟動(dòng)子由E.coli BL21(DE3)基因組上的T7 RNA聚合酶啟動(dòng)，而T7 RNA聚合酶有l(wèi)acUV5啟動(dòng)子控制表達(dá)。在沒有IPTG的情況下，也會(huì)有少量T7 RNA聚合酶表達(dá)，因此存在外源蛋白的本底表達(dá)。宿主需要耗費(fèi)能量與資源去表達(dá)外源蛋白，這對(duì)宿主來說是一種代謝負(fù)擔(dān)，會(huì)或多或少影響到宿主的正常生理功能。在對(duì)數(shù)中期添加IPTG以解除對(duì)lacUV5的抑制(圖3A)，啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。在此之前，宿主需要有足夠的生

物量，這是大量表達(dá)目的蛋白的基礎(chǔ)。用pET20b表達(dá)scFv-H4時(shí)，由于T7啟動(dòng)子不嚴(yán)謹(jǐn)，導(dǎo)致E.coli BL(DE3)/ pET20/H4有較高的本底表達(dá)(圖3B)，這影響了菌體的生長，此后的菌體量一直較低，從而影響了scFv-H4最終的表達(dá)水平。而pET22b能嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乜刂苨cFv-H4的表達(dá)，在未添加IPTG時(shí)，scFv-H4的活性表達(dá)量很低，菌體生物量在對(duì)數(shù)期以及后面的穩(wěn)定期一直都處于比較高的水平；當(dāng)添加IPTG后，有生物活性的scFv-H4迅速表達(dá)，且菌體破碎液中scFv-H4的生物活性明顯高于采用pET20b的情況。

圖3 含有pET20b和pET22b的E.coliBL21(DE3)在表達(dá)scFv-H4過程中的生長曲線(A)和期間具有生物活性的scFv-H4的表達(dá)情況(B)Fig.3 Growth curves ofE. coliBL21 (DE3) using pET20b and pET22b vectors and the bioactivity of scFv-H4 expressed by both constructs

2.5 用pET22b表達(dá)的scFv-H4在E.coli BL21(DE3)分布

pET22b是帶有信號(hào)肽的載體，能引導(dǎo)目標(biāo)蛋白跨越細(xì)胞內(nèi)膜，分泌于細(xì)胞周質(zhì)中。本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)物上清，細(xì)胞周質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)可溶部分和細(xì)胞質(zhì)不可溶部分的電泳圖來分析scFv-H4的分布。

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，由于外膜的限制，很少有蛋白質(zhì)能分泌到培養(yǎng)基中，在細(xì)胞周質(zhì)中的蛋白質(zhì)種類較少，但是有大量可溶性的scFv-H4；而在細(xì)胞質(zhì)可溶部分僅有很少量的scFv-H4，細(xì)胞質(zhì)中的scFv-H4基本上是以不溶性的包涵體形式存在。

2.6 scFv-H4特性的測定

由E.coli BL21(DE3)/pET22b系統(tǒng)表達(dá)的scFv-H4經(jīng)純化后，用競爭ELISA測定其親和力。取質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的scFv-H4與不同質(zhì)量濃度的AFB1溶液混合后，加入AFB1-BSA包被的酶標(biāo)板中。

圖4 scFv-H4培養(yǎng)物各部分的分布情況Fig.4 Distribution of scFv-H4 in cell culture

圖5 scFv-H4的競爭ELISA結(jié)果Fig.5 Binding results of scFv-H4 to AFB1in competitive ELISA

圖5結(jié)果表明，scFv-H4的半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為0.4ng/mL。Moghaddam等[19]從未經(jīng)免疫的人源抗體文庫中通過競爭洗脫篩選到的單鏈抗體的IC50為400ng/mL；而Daly等[20]從免疫過的小鼠單鏈抗體文庫中篩選到的抗體的 IC50為16ng/mL。相比較而言，scFv-H4更為敏感，能檢測到更低濃度的AFB1，所以這個(gè)抗體具有一定的應(yīng)用價(jià)值。scFv-H4與AFB2有12%的交叉反應(yīng)性，與AFG1有42%的交叉反應(yīng)性，與AFG2有9%的交叉反應(yīng)性[16]。

3 結(jié) 論

Wilkinson- Harrison模型預(yù)測表明當(dāng)抗AFB1的scFv-H4在大腸桿菌中大量表達(dá)的時(shí)候，有96.5%的可能形成包涵體。為得到可溶的、有生物活性的scFv-H4，本實(shí)驗(yàn)采用了4個(gè)不同的pET載體pET20b、pET22b、pET28a和pET32a來表達(dá)scFv-H4，其中pET20b和pET22b能將scFv-H4分泌到大腸桿菌的細(xì)胞周質(zhì)中，而pET32a的表達(dá)產(chǎn)物則存在于細(xì)胞質(zhì)中。

pET20b和pET22b能用來表達(dá)有生物活性的scFv-H4，而pET22b的T7lac啟動(dòng)子能嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乜刂苨cFv-H4的本底表達(dá)，從而避免由于誘導(dǎo)后scFv-H4的表達(dá)影響對(duì)數(shù)前

期的細(xì)胞生長。pET22b表達(dá)的scFv-H4分為兩部分：分泌到細(xì)胞周質(zhì)中的有生物活性的可溶性蛋白和在細(xì)胞質(zhì)中的包涵體。而采用pET20b作為表達(dá)載體時(shí)，scFv-H4的本底表達(dá)比較高，影響了細(xì)菌本身的生長和新陳代謝。

pET28a不能用來表達(dá)scFv-H4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沒有明顯的scFv-H4蛋白產(chǎn)生。帶有Trx標(biāo)簽的載體pET32a在E.coli BL21(DE3)中能表達(dá)大量的Trx-scFv-H4融合蛋白，但是都沒有生物活性，把宿主換為細(xì)胞質(zhì)呈氧化性的E.coli Origami(DE3)后，情況并沒有特到改善，所以scFv-H4的正確折疊可能不僅局限于分子中二硫鍵的因素，還需要考慮其他的影響因素如分子伴侶等。

E.coli BL(DE3)/pET22b這樣的表達(dá)系統(tǒng)不僅有利于scFv-H4的表達(dá)，也可能為此類蛋白的表達(dá)提供參考；并有可能為以后的抗體親和力成熟和穩(wěn)定性改進(jìn)奠定良好的基礎(chǔ)。

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Comparison of pET Vectors for the Expression of Single Chain Antibody for Aflatoxin B1

YANG Lian，LIU Zi-qin，LIU Rong，CHEN Hai-qin，CHEN Wei，ZHANG Hao*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective∶ Recombinant antibody expression in microorganism greatly facilitated the affinity and stability studies of recombinant antibodies, but previous studies had less reports about the selection of vectors. A suitable expression vector is important during the expression of the single chain antibody (scFv-H4) for aflatoxin B1. Methods∶ Four pET vectors such as pET20b, pET22b, pET28a and pET32a were employed in the functional expression of scFv-H4. Results∶ pET20b and pET22b vectors were able to express the functional antibody in periplasm. The vector of pET28a was not suitable for the expression of scFv-H4 due to lack of detectable scFv-H4 in total protein. Moreover, the detectable scFv-H4 was only expressed in inclusion body through pET32a expression system. Conclusion∶ pET22b was an excellent vector for the expression of scFv-H4, which might be a good reference for similar protein expression and be useful in the later study of scFv-H4 affinity and stability.

aflatoxin；single chain fragment；expression；Escherichia coli；pET

Q782

A

1002-6630(2010)09-0171-06

2009-10-24

教育部新世紀(jì)人才計(jì)劃資助項(xiàng)目(NCET-06-0482)

楊煉(1978—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：yanglian27@yahoo.com.cn

*通信作者：張灝(1962—)，男，教授，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhanghao@jiangnan.edu.cn