乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假檢測研究進展

楊 光，王加啟*，卜登攀，哈斯額爾敦，劉慶生，孫 鵬，劉開朗，雒秋江

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假檢測研究進展

楊 光1,2，王加啟1,*，卜登攀1，哈斯額爾敦1，劉慶生1，孫 鵬1，劉開朗1，雒秋江2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

闡述兩類方法、一個原則：乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假特異性檢測方法和乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假非特異性檢測方法；任何一種乳品蛋白質(zhì)摻假檢測方法的建立都要以某一特定蛋白質(zhì)差異性為依據(jù)的原則。

乳制品；蛋白質(zhì)摻假；特異性檢測；非特異性檢測；差異性

乳品摻假已成為困擾我國乳品工業(yè)發(fā)展的一個突出問題，三聚氰胺事件將這個問題再一次激化，給我國乳業(yè)帶來一次空前沉重的打擊。

摻假帶來的非法利潤驅(qū)使著摻假者不斷提高和改變摻假手段，以應對越來越先進的摻假檢測技術(shù)。所以，摻假檢測技術(shù)的革新工作任重而道遠。乳品蛋白質(zhì)摻假檢測是一項復雜且艱難的蛋白質(zhì)鑒定與定量工作，它既不同于蛋白質(zhì)的提純(從已知的混合物中提純某一特定的蛋白質(zhì)成分)，也不同于蛋白質(zhì)的區(qū)別鑒定。因為摻假者不會提前告知他是否摻假或摻什么假，而且摻假的蛋白往往都是某些蛋白質(zhì)的混合物或者是蛋白質(zhì)的變性物，還有直接摻入非蛋白氮的。

本文綜述了國內(nèi)外各類乳品蛋白摻假檢測方法的最新研究，將種類繁多、方法各異的乳品蛋白質(zhì)摻假檢測統(tǒng)分為特異性檢測和非特異性檢測，并從種類紛繁的檢測方法中總結(jié)出一條規(guī)律性的原則，即任何一種乳品蛋白質(zhì)摻假檢測方法的建立都要以某一特定蛋白質(zhì)差異性為依據(jù)的原則，旨在為后續(xù)的乳品蛋白摻假檢測方法研究提供參考。

1 乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假的特異性檢測

乳品中特定蛋白質(zhì)摻假檢測就是要在已知的蛋白質(zhì)組分中確定出某一個或一類假定摻假蛋白質(zhì)成分是否存在及其含量，為此必須找到摻假蛋白質(zhì)與乳源蛋白質(zhì)的差異性。而蛋白質(zhì)之間的差異性有分子量的不同、分子結(jié)構(gòu)的差異(包括一級和高級結(jié)構(gòu)的差異)、帶電性與量的不同、溶解度不同、等電點的不同、氨基酸組成的差異、蛋白質(zhì)分子的抗原特異性不同等；此外不同來源的蛋白質(zhì)摻入也會引入其他一些特征性物質(zhì)，也可通過檢測引入物間接檢測摻假蛋白，如動物蛋白中DNA、大豆蛋白中的皂角素等。目前的乳品蛋白質(zhì)摻假檢測方法基本上是基于這些蛋白質(zhì)差異性建立起來的，其涉及了色譜、質(zhì)譜、免疫、P C R、電泳、光譜學、分析化學等技術(shù)領域。

1.1 利用蛋白質(zhì)的氨基酸組成差異性檢測牛奶中摻入的水解蛋白。

不同的蛋白質(zhì)分子氨基酸組成比例不同，通過測定含量差別較大的某個或幾個氨基酸或者特有氨基酸來區(qū)別不同的蛋白成分，即使蛋白質(zhì)發(fā)生變性水解都不會影響測定。而利用氨基酸組成的差別檢測牛奶蛋白中摻入的外源蛋白成分，并不像單一蛋白質(zhì)的區(qū)別鑒定一樣簡單。首先，必須確定牛奶中內(nèi)源蛋白組的總體氨基酸組成，而這個總體的氨基酸組成也是具有個體差異的。其次，摻入的外源蛋白在摻假乳總蛋白中所占的比例很小，大部分仍然是乳源蛋白，所以由于外源蛋白摻入導致的總體氨基酸組成的變化很小，難以檢測。因此，可供牛奶蛋白質(zhì)摻假檢測的氨基酸必須是摻假蛋白質(zhì)含量遠高于乳蛋白，或者是摻假蛋白質(zhì)特有的氨基酸。

1.1.1 利用特有氨基酸檢測牛奶中摻入的水解蛋白

動物膠原水解蛋白為動物皮革毛發(fā)等下腳料經(jīng)水解成可溶性肽鏈，其摻入牛奶中可提高乳蛋白的表觀含量，但嚴重損害消費者的利益。

羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是膠原蛋白所特有的氨基酸，在正常膠原蛋白中含量約為13.4%，在其他蛋白質(zhì)中則不存在[1]。通過檢測牛奶中羥脯氨酸的量，再換算成膠原水解蛋白的量，即可檢測出牛奶中摻入的水解蛋白的含量。李景紅等[2]與田艷玲[3]在濃鹽酸的條件下，110℃水解6h，使膠原蛋白徹底變成游離的氨基酸，其中的羥脯氨酸也被釋放出來。再用氯胺-T氧化羥脯氨酸生成含吡咯環(huán)的物質(zhì)，加入對-二甲基氨基苯甲醛溶液顯色，558nm波長處測吸光度，用標準曲線算得羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，羥脯氨酸的最小檢出量為1.0mg/L。

1.1.2 利用多個特征氨基酸檢測牛奶中摻入的水解蛋白

劉婷等[4]利用高效液相離子交換色譜法尋找水解動物蛋白與乳粉蛋白組成差別較大的氨基酸，對乳粉和水解動物蛋白中的17種氨基酸進行了分離測定，篩選出6種含量差別較大的氨基酸；水解動物蛋白中的甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸和亮氨酸占總氨基酸的含量比例分別為乳蛋白的16、4、6、1/2、1/2倍和1/3倍，乳粉中摻入水解動物蛋白會使前3種氨基酸含量比例升高、后3種氨基酸含量比例下降。依據(jù)此6種氨基酸建立乳粉中水解動物蛋白的半定量檢測方法，先將模擬摻假實驗中所測定出的6種特征氨基酸占總氨基酸的含量比例列于表1。實際檢測中，將檢測到的6種氨基酸的含量比例與表1的數(shù)據(jù)對照，就可以半定量地檢測出樣品中水解動物蛋白的添加比例范圍。

王竹等[5]為評價嬰兒配方乳粉摻假的牛皮水解蛋白質(zhì)對嬰兒健康的潛在危險性時，對牛皮水解蛋白質(zhì)的氨基酸進行評分。采用半定量方法對在阜陽抽檢的60份嬰兒配方乳粉中牛皮水解蛋白質(zhì)的情況進行了檢測與評估。結(jié)果與乳粉相比，牛皮水解蛋白質(zhì)中甘氨酸含量高，含硫氨基酸等必需氨基酸含量普遍低。以FAO/ WHO推薦的嬰兒氨基酸模式為100，牛皮水解蛋白質(zhì)氨基酸評分僅為19。

1.2 利用蛋白質(zhì)的溶解性差異檢測牛奶蛋白質(zhì)摻假

蔣儒林等[6]用硝酸汞沉淀除去乳酪蛋白，但水解蛋白不會被除去，與飽和苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)產(chǎn)生沉淀反應：取100mL乳樣，在水浴中加熱濃縮到60mL，冷卻至20℃取5mL乳樣，加除蛋白試劑5mL混合均勻，過濾，取濾液約1mL，沿試管壁慢慢加入飽和苦味酸溶液約0.5mL形成環(huán)狀接觸面。結(jié)果：正常原乳濾液清亮，加苦味酸試劑后接觸面無變化；摻水解蛋白的原乳，濾液呈半透明，略帶乳青色，加苦味酸試劑后接觸面呈白色環(huán)狀。摻水解蛋白粉越多，濾液越不透明，白色沉淀越明顯，最低檢出量0.1g/100mL乳。

1.3 利用蛋白質(zhì)的抗原特異性檢測羊乳中摻入的牛乳

不同種屬蛋白分子具有不同的分子結(jié)構(gòu)，具有特異性的氨基酸序列片段常被作為特異性決定簇，被機體免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生與之親和的抗體?？乖贵w特異性結(jié)合是免疫學的核心理論，也是免疫測定的理論依據(jù)。目前，免疫方法檢測乳品蛋白摻假主要集中在羊乳及其乳制品中摻入的廉價牛乳成分，方法主要是ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay)法，其建立可分為以下3個步驟。

表1 乳粉中添加不同比例水解動物蛋白的特征氨基酸占總氨基酸的比例Table 1 Ratio between characteristic amino acids and total amino acids in milk powder with the addition of hydrolyzed animal proteins

抗原的選擇：抗原可以用牛乳清蛋白或酪蛋白，也可以是牛αs1-酪蛋白、β-酪蛋白等單一蛋白分子，也有選擇牛IgG為抗原的(表2)?？乖x擇的原則：1)抗原蛋白在牛乳中含量要較高而且穩(wěn)定，這樣可以提高定

量檢測的準確性。2)抗原分子要具有很高的種屬特異性決定簇。也就是牛源性抗原產(chǎn)生的抗體不會與其他種屬抗原結(jié)合，只專一性結(jié)合牛乳中蛋白成分。一般選擇單一蛋白分子做抗原比混合蛋白分子做抗原特異性強。因為牛和羊的種屬差異較小，混合蛋白抗原大大提高交叉抗原出現(xiàn)的機率。García等[7]采用牛乳清蛋白做抗原和Rodríguez等[8]采用牛酪蛋白做抗原生產(chǎn)多克隆抗體，抗血清經(jīng)一次親和純化制得的抗體的專一性很低。

抗體的制備：抗體制備分多克隆抗體和單克隆抗體的制備。一般單克隆抗體的專一性高于多克隆抗體。抗體的專一性越高，檢測的可信度就越高。Anguita等[10]和Hurley等[11]制備的單克隆抗體專一性很強，不需要再用免疫吸附來提高專一性。多克隆抗體一般采用兔抗牛，單克隆抗體多采用鼠抗牛，也有使用羊抗牛多克隆抗體的，羊抗?？贵w最適合羊乳中牛乳的檢測，因為羊的免疫系統(tǒng)對自身抗原免疫耐受，因此羊抗?？贵w不會交叉結(jié)合羊乳蛋白。Hurley等又建立了夾心ELISA檢測羊乳中的牛IgG，就采用多克隆羊抗牛IgG為捕獲抗體，方法具有非常高的專一性，最低檢測限為體積分數(shù)0.01%。

ELISA方法的建立：將制備好的抗體和純化抗原進行固相化或酶標記，建立合適ELISA方法進行檢測。包括間接ELISA、間接競爭ELISA、夾心ELISA都可用于乳蛋白質(zhì)摻假檢測。

1.4 利用蛋白質(zhì)分子量和帶電量的不同進行乳蛋白質(zhì)摻假檢測

蛋白質(zhì)顆粒在各種介質(zhì)中包括在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率決定于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素[12]。

1.4.1 利用SDS-PAGE檢測牛奶中摻入的豆奶蛋白

在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子電泳遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶電荷和分子形狀無關。吳茹怡[13]利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來檢測牛奶中的豆奶成分。將牛奶和豆奶分別進行SDS-PAGE分析，從電泳譜圖上可看到7條牛奶蛋白帶和13條豆奶蛋白帶。牛奶中摻雜的豆奶體積分數(shù)達5%即可被檢測到。

表2 ELISA方法檢測羊乳中的牛乳成分Table 2 Detection of cow milk in ewe milk by ELISA method

1.4.2 毛細管電泳在乳蛋白質(zhì)摻假檢測上的應用

毛細管電泳統(tǒng)指以高壓電場(10～50kV)為驅(qū)動力，以微內(nèi)徑管(一般內(nèi)徑為50μm，外徑為300μm)為分離通道的電泳。電滲作用使溶液向負極流動，由于電滲流速度大于帶電離子的電泳速度，故電泳方向與電滲方向相同的正離子遷移速度最快，中性分子居中，負離子遷移最慢，從而根據(jù)蛋白分子帶電性與量的不同將其分離。

Cartoni等[14]利用毛細管區(qū)帶電泳檢測羊奶產(chǎn)品中摻入的牛乳成分。其中牛乳的定性和定量是依據(jù)乳中具有特異性乳清蛋白的存在。相對校準曲線被制定。該電泳使用甲基硅烷毛細管，以pH值為9.2的硼酸鈉為背景電解質(zhì)，檢測峰具有很高的分辨率。牛乳的最小檢出量在乳混合物中體積分數(shù)2%，在奶酪中體積分數(shù)為4%。個體遺傳差異和可能的熱處理會影響檢測結(jié)果。

張東送等[15]在研究毛細管電泳在牛奶蛋白質(zhì)摻假檢測上的應用時，試圖用毛細管電泳圖譜的比對檢測奶粉中摻入大豆粉；結(jié)果表明，乳中添加大豆蛋白檢測時出現(xiàn)新的特征峰，而且大豆蛋白特征峰面積與添加量成正比。通過直接觀察比對指紋圖譜可檢測到牛乳中摻入質(zhì)量分數(shù)10%的大豆蛋白。

1.5 利用不同的分子結(jié)構(gòu)紅外光吸收譜不同的特點檢測乳粉中的三聚氰胺

1889年Angstrem首次證實紅外吸收產(chǎn)生的根源是分子而不是原子，不久Julius第一次將分子的結(jié)構(gòu)特征和光譜吸收峰的位置直接聯(lián)系起來。紅外吸收檢測方法的建立成為可能。

Mauer等[16]獲取了未摻雜的配方奶粉樣本，并利用近紅外和中紅外光譜技術(shù)測量這些樣本。紅外激光束在樣本上反射并進入了一個探測器，后者計算出激光的能量有多少被樣本吸收，并建立對樣本唯一的一個吸收譜。對純?nèi)矍璋芬彩占送瑯拥臄?shù)據(jù)。把這種配方奶粉與三聚氰胺混合然后進行分析，對新的譜和未摻雜的配方奶粉的譜進行了比較，結(jié)果顯示了樣本中的三聚氰胺的濃度。因為，三聚氰胺的結(jié)構(gòu)與配方奶粉非常不同，因此可以在譜上看出差別，通過計算機軟件程序分析譜線的差異可以檢測到樣品中百萬分之一的三聚氰胺。

1.6利用摻假時引入的其他特殊物質(zhì)進行的間接檢測

由于乳品蛋白質(zhì)摻假時的引入物質(zhì)往往不是蛋白質(zhì)，這樣它與乳源蛋白質(zhì)的差異程度就會更大，更易于被區(qū)別鑒定，而且引入物質(zhì)往往不止一種，可以篩選那些最易檢測的物質(zhì)作為特定摻假物的指示劑。所以引入物的檢測大多可以不依賴于昂貴的儀器和復雜的處理過程，這就為建立現(xiàn)場蛋白質(zhì)摻假的快速檢測方法提供理論依據(jù)。

1.6.1 基于DNA的乳蛋白質(zhì)摻假檢測

蛋白質(zhì)是由mRNA翻譯合成，mRNA是由DNA轉(zhuǎn)錄合成，天然蛋白質(zhì)一般都會或多或少含有原有機體的遺傳物質(zhì)。乳中外源蛋白質(zhì)的摻入會引入該外源有機體的種屬特異性遺傳物質(zhì)，可通過PCR擴增檢測種屬特異性DNA片段來間接檢測外源蛋白。

López-Calleja等[17]使用PCR技術(shù)特異性檢測綿羊和山羊乳中摻入的牛乳，PCR使用了針對線粒體中12S rRNA基因的引物以達到種屬特異性。上游引物與一個保守DNA片段互補結(jié)合，下游引物與牛的特異DNA片段結(jié)合，這樣就擴增出一個223bp的牛乳中DNA片段，而綿羊和山羊的DNA片段不會得到擴增。這個技術(shù)被用在生鮮乳、巴氏殺菌乳和滅菌后的牛-綿羊和牛-山羊混合乳的檢測，它能夠很好的檢測出混合物中的牛乳，具有靈敏的檢測限體積分數(shù)0.1%。

López-Calleja等[18]使用PCR技術(shù)特異性檢測綿羊乳中摻入的山羊乳，PCR使用了針對線粒體中12S rRNA基因的引物以達到種屬特異性。這個山羊種屬特異性引物的使用能擴增出一個122bp的山羊乳DNA片段，而綿羊、母牛和水牛的DNA片段不會得到擴增。這個PCR分析技術(shù)被用在由山羊和綿羊二元混合的生鮮乳、高溫處理乳的特異性檢測上，它能夠很好的檢測出混合物中的山羊乳，最低檢測限為體積分數(shù)0.1%。

Kotowicz等[19]采用雙重PCR檢測山羊乳中的牛乳，該雙重PCR使用兩對能識別線粒體D環(huán)片段序列的引物。該PCR檢測具有很高的特異性和靈敏性，它能檢測到羊奶中體積分數(shù)不到1%的牛奶成分。一對引物是特異性識別牛線粒體DNA片段，另一對引物可識別山羊和牛的線粒體DNA片段以阻止假陰性的發(fā)生。

1.6.2 利用皂角素的特異性反應檢測牛乳中摻入的大豆蛋白

有些摻假者用廉價的豆?jié){摻入牛奶中，以提高牛奶中蛋白含量，而豆?jié){蛋白的摻入引入了易于檢測的大豆中特有的皂角素，可以通過向牛奶中加入醇醚混合液后，再加入25%的氫氧化鈉溶液。10min后若有黃色出現(xiàn)則證明牛奶中摻有豆?jié){[20]。此方法簡單快速，可以用于收奶現(xiàn)場摻假檢測。

1.6.3 利用肌酐的特異性反應檢測生鮮乳中摻入的哺乳動物尿

摻尿原料奶中的肌酐(來自哺乳動物的尿)與堿性苦味酸作用，生成紅色的苦味酸肌酐復合物。取原料奶3mL，加10%氫氧化鈉4滴，混勻，加飽和苦味酸溶液(3g苦味酸溶于200mL蒸餾水)0.6mL；放置5min后觀察現(xiàn)象。黃色說明乳中不含尿，紅色表明乳中摻入尿液。其中，該方法摻牛尿量越多，顯色愈快，顏色愈深。該方法最低檢出量為體積分數(shù)2%。此方法簡單快速，可以用于收奶現(xiàn)場摻假檢測[6]。

1.7 非蛋白含氮物質(zhì)的特異性快速檢測

非蛋白含氮物質(zhì)不是蛋白質(zhì)，其物化性質(zhì)與蛋白質(zhì)有質(zhì)的區(qū)別，利用它們特有的蛋白質(zhì)所不具備的性質(zhì)一般都能將其簡單快速靈敏地檢測出來。

1.7.1 銨鹽的NH4+-KI-NaClO顯色體系法檢測

在中性或堿性介質(zhì)中，NH4+離子可與KI和NaClO溶液作用生成黑色NHI2沉淀，其沉淀物多少與氨或銨離子的含量成正比。試劑：稱取25.0g固體KI加水溶解，并定容到50mL配制成質(zhì)量濃度為500g/L的KI溶液，搖勻備用。稱取5g固體NaOH試劑，加水溶解，冷卻至室溫，并加水稀釋到100mL，配制成質(zhì)量濃度為50g/L的NaOH溶液，搖勻保存?zhèn)溆?。NaClO原液商品安福替民，有效氯(Cl)不少于10%。操作：準確吸取待檢奶樣5mL于10mL具塞比色管中，加入質(zhì)量濃度為50g/L的KI試劑0.5mL，混勻后沿著試管壁緩緩加入體積比為4∶4∶2的NaClO、H2O、NaOH混合液1.0mL，并同時觀察奶樣與最后所加試劑兩者界面處的顏色變化，若出現(xiàn)棕灰至黑色渾濁，表明樣品摻有銨鹽。最低檢出限為16.82μg/mL乳。該法操作簡便快捷，靈敏度高，顯色效果好，試劑配制方便容易保存，易于在收奶現(xiàn)場推廣應用[21-22]。

1.7.2 亞硝酸鹽的檢測

在弱酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，再與α-萘胺偶合形成紫紅色染料。將0.1gα-萘酚、0.2gα-萘胺及0.6g對氨基苯磺酸溶于400mL 50%的冰醋酸中，在棕色瓶中避光保存。取奶樣2mL于試管中，然后加入1.5mL上述配制試劑，搖勻2min后，觀察現(xiàn)象。結(jié)果判定：白色，無亞硝酸鹽；微粉色，含亞硝酸鹽0.2mg/kg；水粉色，含亞硝酸鹽0.3mg/kg；粉紅色，含亞硝酸鹽≥0.4mg/kg[23]。

1.7.3 尿素的檢測

尿素與亞硝酸鹽在酸性溶液中發(fā)生反應生成二氧化碳氣體逸出，而亞硝酸鹽可與格里斯試劑發(fā)生偶氮反應生成紫紅色染料，摻尿素就會影響該反應的發(fā)生。稱取89g酒石酸、10g對氨基苯磺酸和1gα-萘胺，在研

缽中研細混勻制成格里斯試劑后，裝入棕色瓶備用。取被檢乳樣3mL放入大試管中，加入0.05%的亞硝酸鈉溶液0.5mL，加入濃硫酸lmL，將膠塞蓋緊搖勻，待泡沫消失后向試管中加入約0.1g格里斯試劑，充分搖勻，待25min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：紫紅色不含尿素，不變色含尿素。本法靈敏度為0.01g/100mL。因此被檢奶樣最少不能低于2.5mL。本實驗最好以正常牛奶作對照，其結(jié)果會更加準確[24]。

2 乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假的非特異性檢測

國家制定的常規(guī)檢驗方法已不能滿足越來越高明的摻假現(xiàn)狀?，F(xiàn)行的摻假檢驗研究，大多針對某假定的單一物質(zhì)進行定性定量檢測，要實現(xiàn)多個項目的檢測操作繁瑣，尤其是對可能出現(xiàn)的未知物將難以評判。乳及乳制品蛋白質(zhì)摻假的非特異性檢測是指不針對某假定的單一物質(zhì)的乳蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測。

2.1 基于乳品中粗蛋白分析的非特異性檢測

GB/T 5413.1—1997《嬰兒配方和乳粉蛋白質(zhì)的測定》[25]中規(guī)定的乳粉中蛋白質(zhì)分析方法是用凱氏定氮法直接測定乳粉中粗蛋白含量。因為正常情況下，乳品中非蛋白氮含量在總氮中所占比例是基本穩(wěn)定的，因此凱氏定氮法測定的結(jié)果基本能反映樣品蛋白質(zhì)含量水平。該方法測定結(jié)果能有效地篩查出因摻水等非含氮物質(zhì)導致的蛋白營養(yǎng)成分不足量的摻假乳品。

由于凱氏定氮法實際上測定的是樣品中氮元素的含量，一旦人為添加了非蛋白氮(NPN)，該方法就表現(xiàn)出其局限性。陳婧等[26]利用凱氏定氮法測定摻加了水解蛋白的乳粉樣品粗蛋白含量，其結(jié)果較原始值要高。添加水解蛋白中的氮100%被檢出。可見水解蛋白對凱氏定氮法測定乳粉蛋白質(zhì)含量有顯著影響。

2.2 基于乳品中真蛋白分析的非特異性檢測

因為凱氏定氮法有其局限性，現(xiàn)行國際標準ISO 8968-5∶2001/ IDF 20-5∶2001[27]采用三氯乙酸-凱氏定氮法來解決這個問題。先用三氯乙酸沉淀乳品中真蛋白，而非蛋白含氮物(尿素、甘氨酸、硝酸銨、亞硝酸鈉和水解蛋白等)不會被沉淀，利用溶解性的不同將乳品中真蛋白與非蛋白含氮物分離，再用凱氏定氮法測定沉淀物中蛋白質(zhì)含量，其結(jié)果即為乳品中真蛋白含量。這種檢測能夠有效地篩查出摻入非含氮物質(zhì)和非蛋白含氮物質(zhì)(尿素、甘氨酸、硝酸銨、亞硝酸鈉和水解蛋白等)導致的蛋白營養(yǎng)成分不足量的摻假乳品。

然而，劉瑩等[28]在研究添加三聚氰胺對液態(tài)乳中蛋白質(zhì)含量測定方法的影響時，發(fā)現(xiàn)三氯乙酸-凱氏定氮法測定添加了三聚氰胺的液態(tài)奶中蛋白氮含量比理論值偏高，原因是由于三聚氰胺不溶于15%的三氯乙酸溶液，使得三聚氰胺在三氯乙酸作用下無法與液態(tài)乳蛋白質(zhì)分離?？梢?，三氯乙酸-凱氏定氮法的局限性在于其不適用于人為添加了不溶或微溶于三氯乙酸溶液的非蛋白含氮物質(zhì)的乳品中的蛋白氮測定。

雙縮脲分光光度法原理是：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子的肽鍵結(jié)構(gòu)與Cu2+結(jié)合，生成紫紅色絡合物，此絡合物在540nm波長處有吸收峰，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸組成無關[29]。所以雙縮脲分光光度法可認為是肽鍵的特征性反應，而三聚氰胺中沒有肽鍵，其不能與雙縮脲試劑反應產(chǎn)生有色物質(zhì)；但其缺陷是不能區(qū)分真蛋白與水解蛋白等小肽類非蛋白含氮物。

所以，NY/T 1678—2008《乳及乳制品中蛋白質(zhì)的測定 雙縮脲比色法》[30]建立了三氯乙酸沉淀與雙縮脲反應相結(jié)合的乳及乳制品中蛋白質(zhì)的測定方法。這樣就大大擴展了基于乳品中真蛋白分析的非特異性檢測適用性。劉瑩等[28]的實驗中采用三氯乙酸-雙縮脲法測定添加了三聚氰胺、尿素、甘氨酸和水解蛋白的液態(tài)乳蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示該法有效排除以上非蛋白含氮物對乳蛋白質(zhì)測定的影響。

為了尋求盡可能簡便、快捷的乳品真蛋白分析方法，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院將現(xiàn)代信息技術(shù)與上述三氯乙酸-雙縮脲法有機結(jié)合，用數(shù)字圖像的信息采集方式替換分光光度比色的信息采集方式，建立了乳粉蛋白質(zhì)數(shù)字圖像檢測方法(CCMP)[31]，其原理是根據(jù)經(jīng)雙縮脲顯色反應后，乳品中真蛋白的含量與計算機的RGB表色系統(tǒng)中的G值存在良好的線性關系。CCMP除了具有三氯乙酸-雙縮脲法的優(yōu)越性外，其可以同時完成多個樣品的信息采集與分析；與分光光度計比色法相比，該法具有操作簡便、結(jié)果準確、快速高效的優(yōu)點，尤其適宜于流通領域中乳品質(zhì)量的檢測與評價[32]。

2.3 基于乳源蛋白質(zhì)分析的非特異性檢測

乳品中真蛋白的精確檢測導致非蛋白含氮物的摻入已不能為摻假者賺取非法利潤，這將使摻假者去尋找新的摻假物來取代非蛋白含氮物，這種物質(zhì)要滿足兩個條件：一要廉價；二要能避開真蛋白檢測。顯然，廉價的外源真蛋白(非乳源性蛋白)必將會成為首選的摻假物?；谌槠分姓娴鞍追治龅膿郊贆z測并未區(qū)別乳源蛋白質(zhì)和非乳源蛋白質(zhì)，如果在乳品中摻入大豆蛋白等非乳源蛋白質(zhì)，將導致檢測的乳蛋白結(jié)果呈現(xiàn)虛高。

基于乳源蛋白質(zhì)分析的非特異性檢測是將牛奶本身含有的某一個蛋白質(zhì)作內(nèi)標，檢測這個內(nèi)標的含量或其在總蛋白中的比例以間接檢測乳品中乳源蛋白質(zhì)純度，內(nèi)源標記蛋白可以是乳酪蛋白和乳清蛋白，或更具體的蛋白分子。

乳中蛋白質(zhì)的數(shù)量與種類繁多，結(jié)構(gòu)復雜，天然

乳中各種蛋白質(zhì)的含量與比例難以人為模擬，非蛋白質(zhì)(水、糖、油脂、糊精、無機鹽等)的摻入必然會引起蛋白質(zhì)含量的降低，異源蛋白質(zhì)(明膠、豆粉、水解蛋白)及奶源性乳清粉摻假必然會引起蛋白質(zhì)組分的變化。通過對乳固有的總蛋白、乳酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)的種類、含量和相對比例的多指標分析檢測，作為評價乳品質(zhì)量的方法具有優(yōu)越性[33]。

2.3.1 基于酪蛋白的檢測方法

正常乳中酪蛋白占乳蛋白的質(zhì)量比例一般會穩(wěn)定在77%～78%左右，提出酪蛋白質(zhì)量分數(shù)≥73%可以作為乳品摻假檢驗的定量指標[34]。

2.3.1.1 等電點沉淀法測定酪蛋白含量

根據(jù)酪蛋白在等電點大量沉淀，得以分離并測其含量。邵錦震等[35]與張芳等[36]還專門研究了沉淀分離酪蛋白的pH值和溫度條件，發(fā)現(xiàn)pH4.8、溫度55℃時，酪蛋白得率最高。王丹慧等[37]通過向牛乳中加入乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值到酪蛋白等電點(pI4.6)，過濾去除牛乳中酪蛋白，再用凱氏定氮法測定去除酪蛋白前后的蛋白質(zhì)含量，計算差值推算牛乳中酪蛋白含量，進而計算出酪蛋白在粗蛋白中的百分比。程濤等[29]通過pH4.6的HAc-NaAc緩沖液沉淀酪蛋白，經(jīng)離心洗滌后，收集沉淀；然后用雙縮脲法測定沉淀物中蛋白含量，即為酪蛋白含量。結(jié)果，此法測定牛乳中酪蛋白含量具有準確、快速、儀器簡單和重現(xiàn)性好的優(yōu)點。但此法不能排除與酪蛋白共沉淀的大豆蛋白的干擾，這也是沉淀法測酪蛋白的共同缺陷。

2.3.1.2 毛細管電泳法測定酪蛋白占總蛋白的百分比

張東送等[15]利用毛細管區(qū)帶電泳(CZE)測定牛乳中的酪蛋白含量，根據(jù)樣品分離圖譜，運用電泳儀自帶的分析軟件(32Karat Software)，積分各峰面積，計算出酪蛋白占總蛋白比例，結(jié)果如表3所示。

表3 不同樣品中酪蛋白占乳總蛋白的比例(n=20)Table 3 Ratio between casein and total milk proteins in different samples (n=20)

2.3.1.3 免疫方法測酪蛋白含量

宋宏新等[38]將從干酪素中提取的牛β-酪蛋白對新西蘭白兔進行多次皮下免疫注射。采集血清并用硫酸銨沉淀法進行抗體純化，以制備兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗體。最后將純化的抗體用于間接ELISA法檢測牛乳β-酪蛋白的含量。

2.3.2 基于乳清蛋白的檢測方法

Miralles等[39]使用毛細管電泳(CE)、十二烷基磺酸鈉毛細管電泳(SDS-CE)、四階導紫外分光法(UV-4th Der) 3種方法測定生鮮乳(n=21)、巴氏殺菌乳(n=5)、UHT滅菌乳(n=18)的乳清蛋白與乳總蛋白比值，結(jié)果：生鮮乳分別為17.1%、18.5%和17.2%；巴氏殺菌乳分別為16.6%、17.7%、和18.8%；UHT滅菌乳分別為16.8%、17.0%和17.2%。結(jié)果表明，這種檢測方法不受牛奶加工過程中熱處理的影響。

Miralles等[40]還研究了乳蛋白的水解對乳清蛋白與乳總蛋白比值的影響。對儲存0、2、4d的生鮮乳用毛細管電泳(CE)測定乳清蛋白和乳總蛋白比值，發(fā)現(xiàn)比值隨儲存時間而升高，主要是酪蛋白中的κ-酪蛋白和β-酪蛋白的快速降解導致。對儲存0、30、60、90d的UHT滅菌乳進行檢測，乳清蛋白與總蛋白的比值也隨儲存時間的推移而升高，但明顯比生鮮乳升高的慢，因為滅菌后微生物數(shù)量減少，蛋白降解酶也減少。這個實驗給出了乳蛋白質(zhì)在保存過程中自身的變化規(guī)律的相關數(shù)據(jù)，為基于乳清蛋白檢測提供依據(jù)。

3 結(jié) 語

乳制品蛋白摻假特異性檢測和非特異性檢測各有優(yōu)缺點，二者相互補充?？偟膩碚f，特異性檢測追求高精確性，可以定性、定量檢測，但一次檢測只針對某一種蛋白摻假物；而非特異性檢測追求高效性，一次檢測可篩查出某一類蛋白摻假物，但不能準確的定性和定量檢測，誤判率也較特異性檢測高。乳品在整個流通過程中，前期應多采用非特異性檢測，將大量具有明顯摻假特征的生鮮乳銷毀在進入流通領域之前(前期要適當放寬標準，防止誤判)。后期多采用特異性檢測，加工后的乳制品一般保質(zhì)期較長，有充足的時間進行各種精確的特異性摻假檢測，形成寬進嚴出的乳制品市場。

多肽鏈上各種氨基酸殘基的排列順序被稱為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)進而決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的不同導致各種蛋白質(zhì)具有千差萬別的物理化學性質(zhì)。結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異一起構(gòu)成了蛋白質(zhì)之間的差異性。正是基于這些差異性才得以分離、區(qū)別、鑒定、認識各種蛋白質(zhì)分子。乳品中蛋白質(zhì)摻假物檢測的實現(xiàn)同樣離不開這些差異性，沒有任何差異性作為檢測依據(jù)的乳品蛋白摻假檢測方法是不可能實現(xiàn)的。乳品蛋白摻假方法的建立一定要以某一特定的蛋白質(zhì)差異性為依據(jù)。

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Advances in Identification of Protein Adulteration in Milk and Dairy Products

YANG Guang1,2，WANG Jia-qi1,*，BU Deng-pan1，Khas-Erdene1，LIU Qing-sheng1，SUN Peng1，LIU Kai-lang1，LUO Qiu-jiang2
(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China；2. Laboratory of Animal Nutrition, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

Two methods with one principle for identifying protein adulteration in milk and dairy products have been summarized in this paper. Two methods were focused on specific and non-specific identification of protein adulteration in milk and dairy products. The main principle for establishing these detection methods was concentrated on the difference among specific proteins in adulterated milk and dairy products.

dairy products；protein adulteration；specific identification；non-specific identification；difference

TS252

A

1002-6630(2010)09-0306-07

2009-08-16

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項(nycytx-04-01)

楊光(1981—)，男，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究。E-mail：yang.guang413@yahoo.com.cn

*通信作者：王加啟(1967—)，男，研究員，博士，主要從事反芻動物營養(yǎng)和牛奶質(zhì)量改良研究。E-mail：wang-jia-qi@263.net