王 曦，羅 霞，許曉燕，余夢瑤，喻春蓮，江 南，曾 瑾，楊志榮,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比較研究

王 曦1，羅 霞2，許曉燕2，余夢瑤2，喻春蓮3，江 南2，曾 瑾2，楊志榮1,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

目的：比較不同乳酸菌菌株的抗氧化能力，為其天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。方法：通過羥自由基清除實驗，超氧陰離子自由基清除實驗，DPPH自由基清除實驗以及還原能力測定實驗，對35株乳酸菌的菌體、無細胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進行研究。結(jié)果：比較發(fā)現(xiàn)La 5和La 29兩株乳酸菌抗氧化能力相對較高。結(jié)論：不同來源的乳酸菌菌株還原能力不同，且在羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力方面存在差異；且其發(fā)揮抗氧化作用的活性物質(zhì)存在的部位也因菌株的不同而具有較大的差異性。

乳酸菌；抗氧化能力；自由基；還原能力

自由基是一類帶有未配對電子的離子、原子、分子的基團，在生物體內(nèi)正常代謝時所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，隨著年齡的增長，生物體內(nèi)自由基的增加將導(dǎo)致機體的損傷。研究表明：人類的衰老[1-2]及一些疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病等[3-5]都與自由基的產(chǎn)生有關(guān)。開發(fā)抗氧化劑，加強機體的抗氧化能力，對清除機體自由基、保護細胞免受損傷具有非常重要的意義。隨著人們對抗氧化劑研究的深入，對人工合成抗氧化劑的安全性問題提出質(zhì)疑[6]。因此，從自然界尋求天然抗氧化劑的研究已成為熱點。

目前研究表明，乳酸菌具有許多的保健功能，如抗癌[7-10]、健胃整腸[8]、抗氧化[8]、抑菌抗病[9-10]。作為天然抗氧化劑的一種，乳酸菌的抗氧化能力一直受到人們的重視。研究已經(jīng)證明，一些乳酸菌具有抗氧化活性，但在對乳酸菌的抗氧化能力研究中，對象多是針對某一株或幾株菌株，較少廣泛比較不同屬乳酸菌，同時也缺乏對其活性物質(zhì)存在部位全面、具體的分析比較。張鳳敏等[11]只對L1001、F12這兩株乳酸菌的菌體及無細胞提取物清除DPPH自由基的能力作相關(guān)研究。張江巍等[12]僅對L3和L4兩株乳酸菌的無細胞提取物抗氧化能力進行檢測分析。

本研究就是通過羥自由基清除實驗、超氧陰離子自

由基清除實驗、DPPH自由基清除實驗以及還原能力測定實驗，對不同來源的35株乳酸菌的菌體、無細胞提取物及胞外分泌物的抗氧化能力進行檢測、比較。以了解不同乳酸菌抗氧化能力的高低及其活性物質(zhì)存在的主要部位，這樣既可以根據(jù)不同要求選擇理想的乳酸菌菌株和菌株的具體利用部位，也為合理利用開發(fā)乳酸菌抗氧化制劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

35株乳酸菌菌株，編號為：La 1～La 35。La 1～La 15屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，La 16～La 33屬于鏈球菌屬(Strptococcus)，La 34、La 35屬于明串珠菌屬(Pedicocus)，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院分離、保存。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

二苯代苦味肼基自由基(DPPH) Sigma公司；鄰二氮菲、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、過氧化氫、Tris-Base、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、三氯乙酸、三氯化鐵等試劑均為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：M R S培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外-可見分光光度計 中國北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Centrifuge 5810R冷凍高速離心機 美國Eppendorf公司；DELTA320 pH計 美國梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-50KBS壓力蒸汽滅菌器 中國上海申安醫(yī)療器械廠；UH-800A UH系列超聲波細胞粉碎儀 美國Autoscience Instrument公司；ZHWY-2118恒溫培養(yǎng)振蕩器 中國上海智城分析儀器制造有限公司；H-HB-11360-BS培養(yǎng)箱 中國上海躍進醫(yī)療機械廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的培養(yǎng)

乳酸菌菌株于37℃在MRS培養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)24 h，再以10%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜止培養(yǎng)24h。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 菌體的制備

培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液5000r/min離心15min，收集菌體，并用雙蒸水洗滌3次，最后用雙蒸水將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整到1010cells/mL，即為待測樣品。

1.3.2.2 胞外分泌物的制備

培養(yǎng)24h后，收集發(fā)酵液，用雙蒸水將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整到1010cells/mL，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，即為胞外分泌物。

1.3.2.3 無細胞提取物的制備

培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液5000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集菌體，并用雙蒸水洗滌3次，將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整到1010cells/mL，再在冰浴中超聲破碎細胞，破碎液于6000r/min離心10min，收集上清，即為待測樣品。

1.3.3 乳酸菌抗氧化活性的檢測

1.3.3.1 清除羥自由基實驗

參照文獻正文中的方法[13-14]，并略有改進如下：在試管中分別加入1mL的0.05mol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液，0.5mL 6m mol/L的鄰二氮菲，充分混勻后，加入0.5mL 6mmol/L的FeSO4溶液，加入后立即混勻。然后向其中加入0.5mL的樣品溶液，混勻，再加入0.5mL 0.1%的H2O2，最后補充體積到4mL，同時做空白實驗。另再做損傷管和未損傷管，其中，損傷管中加入0.5mL 0.1%的H2O2，未損傷管不加H2O2，最后均將體積補充到4mL。于37℃保溫1h，測其在536nm波長處的吸光度。

式中：A為不加樣品時溶液的吸光度；A0為不加樣和H2O2時溶液的吸光度；Ai為加樣品時溶液的吸光度。

1.3.3.2 清除超氧陰離子自由基實驗

[15-16]中的方法，并略有改進如下：取2mL的50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液，與0.91mL H2O，50μL樣品，混均后加入40μL濃度為10mmol/L的鄰苯三酚溶液，記錄其在320nm波長處的吸光度。計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。

式中：△A0為空白溶液的吸光度隨時間的變化；△A為樣品溶液的吸光度隨時間的變化。

1.3.3.3 清除DPPH實驗

參照文獻[17-19]中的方法，并略有改進如下：1mL待測液加1mL濃度為0.2mmol/L的DPPH，室溫下靜置30min后，在517nm波長處測吸光度變化。

式中：Ai為1mL的DPPH+1mL樣品的吸光度；Aj為1mL溶劑+1mL樣品的吸光度；A0為1mL DPPH+1mL溶劑的吸光度。

1.3.3.4 還原能力的檢測方法

參考文獻[20-21]中的方法，并略有改進如下：取0.5mL樣品加入濃度為0.2mol/L，pH 6.6的磷酸緩沖溶液0.5mL及1g/100mL鐵氰化鉀0.5mL，于50℃水浴20min，急速冷卻。再加入10g/100mL三氯乙酸0.5mL，3000r/min離心5min，取上清液1mL，加入1mL蒸餾水及1mL 0.1g/100mL三氯化鐵，混合均勻。10min后，于700nm波長測定其吸光度。吸光度越大表示待測樣品的還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對羥自由基清除能力的比較

鄰二氮菲-Fe2+水溶液在該反應(yīng)中作為氧化還原指示劑，其顏色變化可反應(yīng)樣品氧化還原的狀態(tài)。體系中H2O2與Fe2+通過Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生具有很強氧化性的羥自由基，若向其中加入羥自由基清除劑，羥自由基的濃度減少，F(xiàn)e2+濃度增加，體系吸光度也相應(yīng)升高。因此，可以根據(jù)加入樣品前后吸光度的變化來反應(yīng)羥自由基的增加或減少。

表1 乳酸菌菌體羥自由基清除率Table 1 Scavenging capability of lactic acid bacteria to hydroxyl free radicals

本實驗對35株菌株的菌體、無細胞提取物和胞外分泌物的羥自由基清除能力進行了研究。這35株乳酸菌無細胞提取物的羥自由基清除率均為零，胞外分泌物的羥自由基清除能力較弱，僅菌體表現(xiàn)一定的清除能力。由表1可知，不同乳酸菌對羥自由基的清除能力差異很大。其中La 4和La 5這兩株菌株的菌體具有相當強的清除羥自由基能力，清除率分別為91.022%和98.460%。而其余33株乳酸菌的清除率均較低，小于20%，La 31的羥自由基清除率最低，僅為1.301%。分析其原因可能是不同乳酸菌清除羥自由基的活性物質(zhì)不同或活性物質(zhì)含量不同。同時檢測出乳酸菌的不同部位抗氧化的能力也不同：無細胞提取物無清除能力，而菌體的清除能力較強。這表明乳酸菌菌體的表面組成成分中有較多清除羥自由基的活性物質(zhì)。

2.2 乳酸菌對超氧陰離子自由基清除能力的比較

該反應(yīng)體系中的鄰苯三酚在堿性條件下自氧化，產(chǎn)生超氧陰離子及有色中間產(chǎn)物，加入超氧陰離子清除劑后會抑制有色產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此可以通過比色法進行定量分析。

表2 乳酸菌胞外分泌物的超氧陰離子自由基清除率Table 2 Scavenging capability of extracellular secretion from lactic acid bacteria to superoxide anion free radicals

結(jié)果表明只有其中3株乳酸菌的無細胞提取物和19株乳酸菌的菌體具有微弱的超氧陰離子自由基清除能力，清除率范圍在0.1%～1.77%。而全部乳酸菌的胞外分泌物均檢測出具有一定的清除能力。由表2可知，有19株乳酸菌胞外分泌物的清除率大于50%，其中La 29的胞外分泌物超氧陰離子自由基清除率最高，達到98.971%。同時也檢測出，La 17的清除能力最弱，清除率僅為8.199%。實驗表明，清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)主要存在于乳酸菌的代謝分泌物中。

2.3 乳酸菌對DPPH自由基清除能力的比較

DPPH自由基是一種常見的篩選和評價抗氧化劑的有效方法，該法廣泛用于自由基清除劑的篩選研究。

檢測結(jié)果表明乳酸菌的菌體DPPH自由基清除率均為零，沒有顯示出具有清除DPPH自由基的能力，而胞外分泌物和無細胞提取物表現(xiàn)出一定的清除能力。由表3可知，乳酸菌的胞外分泌物和無細胞提取物對清除D P P H自由基的能力差異較大，清除率的范圍在0.031%～98.153%，且除La 5外的所有乳酸菌胞外分泌物清除率高于其無細胞提取物。乳酸菌中胞外分泌物清除率最大的是La 29，為51.351%，最低的是La 1，為6.017%。乳酸菌無細胞提取物清除率最大的是La 5，達到98.153%，同時檢測到，其余34株乳酸菌的無細胞提取物清除率很低，最低的是La 22，為0.031%。這說明，乳酸菌清除DPPH自由基的活性物質(zhì)可能是代謝分泌物，細胞內(nèi)物質(zhì)也有一定的活性物質(zhì)。

表3 乳酸菌菌株胞外分泌物和無細胞提取物的DPPH自由基清除率Table 3 Scavenging capabilities of extracellular secretion from lactic acid bacteria and cell-free extract to DPPH free radicals

2.4 乳酸菌還原能力的比較

鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)在pH值為6.6的磷酸緩沖液提供的弱酸環(huán)境下，還原生成黃血鹽(K4Fe(CN)6)，其再與三氯化鐵提供的三價鐵離子作用生成普魯士藍(Fe4[Fe (CN)6]3)。還原能力是以測定普魯士藍的生成量為指標，以其在700nm波長的吸光度大小來測定物質(zhì)的還原能力大小。A700nm越大，其還原能力越大。

表4 乳酸菌菌株胞外分泌物的還原能力Table 4 Reducing powder of extracellular secretion from lactic acid bacteria

檢測結(jié)果表明所有乳酸菌均表現(xiàn)一定的還原能力，A700nm的范圍在0.001～3.169，而乳酸菌的胞外分泌物還原能力相對較強，由表4可知，La 2 9的胞外分泌物還原能力最強，A700nm為3.168；而La 12的還原能力最低，A700nm僅為0.029。實驗表明：乳酸菌具還原能力的活性物質(zhì)存在于細胞內(nèi)，菌體表面及代謝分泌物中。但不同乳酸菌活性物質(zhì)含量或存在部位不同。

3 討 論

近年來，乳酸菌抗氧化的研究逐漸引起科學(xué)家的廣泛重視，但相關(guān)報道不多，具體研究內(nèi)容包括兩種模型：體內(nèi)抗氧化實驗和體外抗氧化實驗。體內(nèi)抗氧化實驗主要是用抗氧化劑喂食動物，檢測其血液和組織中主要的抗氧化酶，如超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等的活性及含量[6]。本研究主要是對不同乳酸菌菌株的體外抗氧化模型的3種自由基清除率及還原能力進行測定。目前研究乳酸菌無細胞提取物的抗氧化性較多，但沒有具體比較分析抗氧化活性物質(zhì)的分布部位，本實驗在比較不同乳酸菌抗氧化能力的同時，也研究不同菌株抗氧化活性物質(zhì)的分布部位。

實驗表明，La 5的菌體對羥自由基清除率最高(98.460%)，其無細胞提取物對DPPH自由基具有最高的清除率(98.153%)；La 29的胞外分泌物對超氧陰離子自由基清除率最高(98.971%)，并且還原能力也最強，A700nm為3.168。由此，篩選得到La 5和La 2 9兩株抗氧化能力相對較強的乳酸菌菌株，可用于抗氧化劑的進一步開發(fā)應(yīng)用。

通過研究還發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差異，可能是起抗氧化作用的活性物質(zhì)本質(zhì)或濃度不同；并且，同一株乳酸菌的菌體、無細胞提取物及胞外分泌物的抗氧化能力也存在較大差異，這揭示了其抗氧化的活性物質(zhì)存在于不同部位；同時，由于不同的菌株其還原能力及清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基能力的不同，導(dǎo)致其抗氧化機制有所差異。

目前對乳酸菌抗氧化能力的研究和利用多是針對活菌體及無細胞提取物，然而本研究表明，抗氧化活性物質(zhì)較多分布在乳酸菌胞外分泌物中，菌體和無細胞提取物分別只對羥自由基、DPPH自由基有相對強的清除能力。因此，以后進一步的產(chǎn)品開發(fā)中，乳酸菌體外分泌物可作為研究重點。乳酸菌抗氧化制劑的研發(fā)應(yīng)該根據(jù)其產(chǎn)品的開發(fā)特點，并結(jié)合菌株自身的優(yōu)勢有目地的對其進行選擇，以利于開發(fā)出生產(chǎn)成本低廉、療效明確的符合市場需求的抗氧化制劑產(chǎn)品。

在本研究的基礎(chǔ)上，我們將篩選出的有效菌株La 5、La 29進一步做體內(nèi)抗氧化模型，同時分析乳酸菌抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，分離研究抗氧化活性物質(zhì)，并對目前尚不太清除的乳酸菌抗氧化作用機制作深入研究。同時，因為抗氧化與許多疾病緊密聯(lián)系，可將篩選出的優(yōu)良安全菌株開發(fā)成具保健功能的產(chǎn)品，對豐富乳酸菌附加值具有重要的意義。

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Comparative Studies on Antioxidant Activities of Different Lactic Acid Bacterial Strains

WANG Xi1，LUO Xia2，XU Xiao-yan2，YU Meng-yao2，YU Chun-lian3，JIANG Nan2，ZENG Jin2，YANG Zhi-rong1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education, College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610065, China；2. Sichuan Province Chinese Medicine Institute, Chengdu 610041, China；3. Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

Objective∶ In order to provide theoretical evidences for developing novel natural antioxidants, antioxidant activities of different lactic acid bacterial strains were compared in this paper. Methods∶ The antioxidant capabilities and reducing activities of 35 lactic acid bacterial strains from intact cells, cell-free extracts and extracellular secretions were evaluated through scavenging capabilities of hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals. Results∶ La 5 and La 29 displayed the excellent antioxidant activity among 35 lactic acid bacterial strains. Conclusion∶ Different fractions from lactic acid bacteria have different scavenging capabilities in vitro. Therefore, lactic acid bacteria from difference resources, concentrations and excretion places also exhibited different antioxidant activities.

actic acid bacteria；antioxidant activity；free radicals；reducing activity

Q949.91

A

1002-6630(2010)09-0197-05

2009-08-06

四川省青年科技基金項目(08ZQ026-014)

王曦(1985—)，女，碩士研究生，主要從事微生物研究。E-mail：micwxi@163.com

*通信作者：楊志榮(1951—)，男，教授，主要從事資源微生物研究。E-mail：bioyang@163.com