聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)HBsAg陰性樣本中病毒核酸的檢測(cè)

房景霞 劉宇思 孫紹秋 李玉梅 房輝

乙型肝炎是HBV感染引起的全球性疾病，而我國是乙型肝炎的高度流行區(qū)。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，在我國人群(＞3歲)中HB-sAg攜帶率為9.09%，HBV流行率高達(dá)60%以上［1］。發(fā)病例數(shù)約為50萬［2］，乙型肝炎的主要傳播途徑是臨床輸血傳播，我國各級(jí)采供血機(jī)構(gòu)對(duì)乙型肝炎的篩查檢測(cè)為酶聯(lián)免疫檢測(cè)，但由于酶聯(lián)免疫吸附法(ELLSA)檢測(cè)“窗口期”的問題，標(biāo)本檢測(cè)漏檢在所難免。我站自2008年9月至2009年1月，對(duì)無償獻(xiàn)血者血液樣本HBsAg ELISA檢測(cè)陰性的合格樣本(共計(jì)26 109份)行PCR檢測(cè)，對(duì)PCR檢測(cè)HBV DNA陽性的血液做報(bào)廢處理，并對(duì)這種獻(xiàn)血者跟蹤驗(yàn)證，每兩周采血做HBV兩對(duì)半免疫檢測(cè)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我站無償獻(xiàn)血者HBsAg ELISA檢查合格血液標(biāo)本(共計(jì)26 109份)，分離血漿備用。DP1000核酸提取儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)，ABI7300熒光PCR擴(kuò)增儀(上?？迫A)。試劑乙型肝炎熒光PCR試劑盒(上?？迫A生物有限公司，批號(hào):20080328)。

1.2 方法

1.2.1 核酸篩查的樣本準(zhǔn)備和匯集:采用Pooling-8方式，分別取所選定的8份血漿各150μl至1.5 ml離心管中振蕩混勻，加入40μl濃縮劑，再加入50μl促沉劑，混勻后4℃離心1 h(26 000 r/min)，棄去離心管內(nèi)上層液體，剩余約160μl標(biāo)本，振蕩混勻，低速離心數(shù)秒后用于核酸提取。

1.2.2 核酸提取:從每個(gè)離心管中吸取100μl待測(cè)匯集標(biāo)本，加入去抑制劑磁珠混合溶液20μl，再加入130μl裂解液，采用核酸提取儀，根據(jù)儀器提示，依次加入洗滌液A、B、C及洗脫液，分離提取HBV DNA模板。

1.2.3 PCR擴(kuò)增檢測(cè):在裝有已配制好的PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中分別加入15μl已處理好的標(biāo)本。然后將PCR反應(yīng)管放入ABI7300熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。PCR反應(yīng)程序:通過預(yù)變性:95℃，2 min;變性:95℃，10 s;退火:55℃，20 s;延伸:72℃，20 s循環(huán)檢測(cè)。

1.3 結(jié)果判定 測(cè)定CT值≥50，并且內(nèi)標(biāo)CT＜45的標(biāo)本為陰性標(biāo)本，測(cè)定CT值在40～50的標(biāo)本為灰區(qū)標(biāo)本，建議復(fù)測(cè)或隨訪，測(cè)定CT值＜40的標(biāo)本為HBV DNA陽性標(biāo)本，須進(jìn)行拆分。

1.4 陽性混合樣本的拆分 混合樣本陽性者均應(yīng)進(jìn)行拆分，找到各個(gè)樣本并分別進(jìn)行單獨(dú)的核酸檢測(cè)，以確定陽性樣本的真正來源。并對(duì)HBV DNA陽性獻(xiàn)血者血液做報(bào)廢處理。

1.5 隨訪 所有HBsAg陰性，HBV DNA陽性的樣本都進(jìn)行隨訪，并做HBV兩對(duì)半免疫檢測(cè)，再次采血應(yīng)用不同于二次篩查的試劑進(jìn)行HBsAg ELISA檢測(cè)，以便查找ELISA檢測(cè)與核酸檢測(cè)結(jié)果不一致的原因。

2 結(jié)果

2.1 PCR篩查結(jié)果 26 109份HBsAg陰性無償獻(xiàn)血標(biāo)本，PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性26 107份，陽性2份，ELISA漏檢率為7/10萬。

2.2 對(duì)2份PCR陽性獻(xiàn)血者血樣做HBV兩對(duì)半免疫檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1 2份PCR陽性標(biāo)本乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果

2.3 2名PCR陽性獻(xiàn)血者追蹤隨訪結(jié)果 見表2。

表2 2名PCR陽性獻(xiàn)血者HBsAg追蹤隨訪結(jié)果

3 討論

HBV隱匿性感染常見于血清中僅有抗-HBc陽性的人群，表現(xiàn)為HBsAg表達(dá)水平低或不表達(dá)，而在血清或肝組織中能檢測(cè)到的HBV DNA，也多為病毒滴度很低。參照文獻(xiàn)［3］本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果26 109份HBsAg陰性的合格樣本中共檢出HBV DNA陽性血樣2例，檢出率為7/10萬。對(duì)該2名獻(xiàn)血者進(jìn)行乙肝兩對(duì)半追蹤檢測(cè)，其中一名獻(xiàn)血者抗-HBc陽性，另一名獻(xiàn)血者檢測(cè)為陰性，后進(jìn)行2～12周HBsAg檢測(cè)，1名獻(xiàn)血者轉(zhuǎn)陽，另1名雖然未轉(zhuǎn)陽，卻并不能排除HBV感染，可能是因?yàn)镠BsAg的表達(dá)水平低于檢測(cè)的最低限度?？梢娧鍖W(xué)檢測(cè)HBsAg陰性并不能完全排除HBV感染。基于目前檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑靈敏度不夠，難以檢出HBsAg呈低水平的人群的這種狀況，人們開始探討使用核酸檢測(cè)技術(shù)，核酸檢測(cè)技術(shù)可以顯著縮短血液感染病毒的檢測(cè)“窗口期”，降低經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)。能提前20 d篩查出HBsAg陰性、HBV DNA陽性獻(xiàn)血者，因此核酸檢測(cè)技術(shù)比ELISA更靈敏，盡管從理論上并不能完全排除“窗口期”，但病毒核酸轉(zhuǎn)陽前的傳染性很低［4］，因此將核酸檢測(cè)技術(shù)用于血液篩查對(duì)提高輸血安全有著重要的意義。但PCR只能檢出復(fù)制狀態(tài)的病毒，難以表達(dá)非復(fù)制狀態(tài)的感染，因而用PCR方法檢測(cè)HBV DNA也不能完全代替血清標(biāo)志物的檢測(cè)。

要加強(qiáng)對(duì)獻(xiàn)血者的篩選，首先應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HBsAg，去除HBsAg陽性血液，然后在此基礎(chǔ)上建議對(duì)HBsAg陰性血液加做PCR對(duì)HBV DNA核酸檢測(cè)，去除HBV DNA陽性血液，以確保輸血的安全。

1 梁曉峰，陳園生，王曉軍.中國3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學(xué)研究.中華流行病學(xué)雜志，2005，26:655-658.

2 王憬惺.乙型肝炎和輸血.中國輸血雜志，2006，19(增刊):16-18.

3 王良華，葉賢林，尚桂芳，等.免疫篩查陰性獻(xiàn)血者血樣病毒核酸檢測(cè)的研究.中國輸血雜志，2005，18:286-289.

4 季陽主編.輸血相關(guān)乙型肝炎及丙型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷.輸血與輸血技術(shù).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.218-220.