CXCR4、HPA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義

姚繼方 王明正 王朋

腫瘤轉(zhuǎn)移是由諸多因素決定的多步驟、序貫性的生物學(xué)過程，它涉及腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、遷移、粘附、侵襲、生長、新血管生成、逃避免疫等幾個關(guān)鍵步驟，但具體機(jī)制仍不清楚。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌80%以上，很多患者就診時已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移是影響NSCLC患者5年生存率的重要因素，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。近年來，趨化因子及其受體所介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移“歸巢”信號機(jī)制的提出，豐富和發(fā)展了Paget的“種子與土壤”學(xué)說，研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子及其受體所介導(dǎo)的腫瘤特異性器官轉(zhuǎn)移主要是通過基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)/趨化因子受體-4(CXCR4)通路實(shí)現(xiàn)的［1，2］。乙酰肝素酶(HPA)是體內(nèi)唯一可以水解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的內(nèi)切酶，研究發(fā)現(xiàn)HPA活性增強(qiáng)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［3，4］。本研究采用免疫組化的方法，通過對NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本檢測CXCR4、HPA的表達(dá)，并與正常肺組織進(jìn)行對比，結(jié)合患者臨床病理資料，探討CXCR4、HPA在NSCLC中發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為判斷NSCLC的生物學(xué)行為提供參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年3至12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除的NSCLC組織標(biāo)本52例，同時取20例正常肺組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)標(biāo)本作為對照。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，HE染色后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。所有病例均無術(shù)前化療、放療治療史。其中男42例，女10例;年齡40～74歲，平均年齡62.40歲;鱗癌22例，腺癌17例，腺棘細(xì)胞癌10例，粘液表皮樣癌2例，透明細(xì)胞癌1例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例;臨床分期采用國際抗癌協(xié)會(UICC)2009年公布的NSCLC TNM分類分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ與Ⅱ期29例，Ⅲ與Ⅳ期23例。

1.2 試劑與方法 兔抗人CXCR4單克隆抗體購自Abcam(Hong Kong)公司，兔抗人HPA單克隆抗體購自SANT CRUZ生物技術(shù)公司，即用型Biotin SP-HRP免疫組化染色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，濃縮型DAB試劑盒購自中國中杉金橋試劑公司。采用免疫組織化學(xué)S-P法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判定 CXCR4、HPA陽性染色定位于細(xì)胞漿，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽性細(xì)胞。參照Andre等［5］評分標(biāo)準(zhǔn)，隨即選取5個高倍視野(×400)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，采用半定量的方法進(jìn)行，根據(jù)免疫組化染色陽性腫瘤的比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分:無陽性細(xì)胞0分，＜10%1分，10% ～50%2分，＞50%3分;無著色0分，輕度著色(淺黃色)1分，中度著色(棕黃色)2分，重度著色(棕褐色)3分。將上述兩項(xiàng)得分相加:＜3分為陰性(－)，≥3分為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩變量之間的分析采用Spearman等級相關(guān)分析，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織和正常肺組織中 CXCR4的表達(dá) 52例NSCLC組織中CXCR4陽性表達(dá)率為63.46%(33/52)，20例正常肺組織中CXCR4陽性表達(dá)率為15%(3/20)，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。在NSCLC組織中，CXCR4與患者性別、年齡、腫瘤組織學(xué)類型、分化程度無關(guān)(P＞0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤 TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CXCR4表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組CXCR4表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組(P ＜0.05)。見表 2。

表1 CXCR4，HPA在正常肺組織和NSCLC組織中的表達(dá)例(%)

2.2 NSCLC組織和正常肺組織中HPA的表達(dá) 52例NSCLC組織中HPA陽性表達(dá)率為55.77%(29/52)，20例正常肺組織中HPA陽性表達(dá)率為10%(2/20)，前者明顯高于后者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。在NSCLC組織中，HPA與患者性別、年齡、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分化程度無關(guān)(P＞0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，即有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPA表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=9.433，P＜0.01)，Ⅲ、Ⅳ組 HPA 表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組(χ2=5.504，P＜0.05)。見表2。

表2 CXCR4，HPA在NSCLC組織的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性例

2.3 用Spearman等級相關(guān)分析CXCR4、HPA兩者之間表達(dá)的相關(guān)性 CXCR4、HPA在NSCLC組織中的表達(dá)經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.289，P=0.038)。見表3。

圖2 HPA在NSCLC組織中的表達(dá)(SP×400)

圖1 CXCR4 NSCLC組織中的表達(dá)(SP×200)

表3 CXCR4與HPA兩表之間表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

近年來肺癌的發(fā)病率不斷上升，每年約有110萬人死于肺癌［6］。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，也是影響患者5年生存率的重要因素，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個非隨機(jī)的、高度組織器官選擇性的生物學(xué)過程，近年來研究發(fā)現(xiàn)趨化因子及其受體在腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［7］。Muller等［8］報(bào)道，乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶高表達(dá)CXCR4，在乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位高水平地表達(dá)其配體SDF-1，CXCR4與SDF-1結(jié)合可引起乳腺癌細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的聚合與再分布，調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動和遷移。Ottaiano等［9］對結(jié)直腸組織的研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4的表達(dá)在正常黏膜、結(jié)腸息肉組織、結(jié)直腸癌組織中呈逐漸上升趨勢，并且結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移者CXCR4的表達(dá)均為高表達(dá)，結(jié)直腸癌及發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌CXCR4表達(dá)顯著高于正常組織。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXCR4至少在23種不同類型腫瘤中均有表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞表達(dá)最為普遍的趨化因子受體，并且和患者的預(yù)后相關(guān)［10］，研究者推測高表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞，可能在SDF-1趨化、牽引下，逆濃度梯度轉(zhuǎn)移至作為配體產(chǎn)生源的某些器官，從而形成器官特異性轉(zhuǎn)移［11，12］。

腫瘤細(xì)胞要實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移，必須穿過由細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜構(gòu)成的屏障。糖氨聚糖是基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，HPA是一種可以特異性降解HSPG中糖鏈的內(nèi)切酶，近年來研究發(fā)現(xiàn)HPA過表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能具有相關(guān)性，并可能影響患者的預(yù)后。Han等［13］用免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)79例食管癌切除標(biāo)本中有52例HPA表達(dá)陽性，腫瘤組織中HPA的表達(dá)比癌旁組織和正常組織中明顯增高，并且與腫瘤的浸潤深度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Vlodavsky等［14］檢測了不同轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞中HPA的活性，發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞中HPA活性比低轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞中高4～10倍，將HPAcDNA導(dǎo)入無轉(zhuǎn)移潛力的鼠淋巴瘤細(xì)胞及低轉(zhuǎn)移潛力的黑色素瘤，這些細(xì)胞獲得了高轉(zhuǎn)移潛能。Parish等［15］采用乙酰肝素酶抑制劑后，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率降低約40%，腫瘤周圍血管減少了30%，證實(shí)了HPA具有促進(jìn)新生血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

蘇麗萍等［16］研究認(rèn)為肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移在某種程度上是由于XCR4、SDF-1的相互作用導(dǎo)致，CXCR4、SDF-1的相互作用可以觸發(fā)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的多個事件的發(fā)生，如腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力、與血管內(nèi)皮的黏附能力等。HPA可以裂解連接于細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重要組成成分，破壞其完整性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此我們推測CXCR4與HPA之間可能存在相關(guān)性，為此我們檢測了NSCLC組織中CXCR4、HPA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中CXCR4、HPA的表達(dá)與正常肺組織相比，NSCLC組織中高水平表達(dá)CXCR4、HPA，為了進(jìn)一步探討CXCR4、HPA在NSCLC組織中高表達(dá)的臨床意義，我們分析了CXCR4、HPA在NSCLC組織中的表達(dá)和患者臨床特征之間的關(guān)系，初步研究結(jié)果顯示CXCR4、HPA的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、組織學(xué)類型無明顯關(guān)聯(lián)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，CXCR4陽性表達(dá)與HPA陽性表達(dá)呈正相關(guān)，提示CXCR4與HPA可能共同參與NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，CXCR4、HPA在NSCLC組織中高表達(dá)，提示兩者可能共同參與NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測CXCR4、HPA有助于判斷NSCLC的轉(zhuǎn)移潛能和患者的預(yù)后，可能為NSCLC的治療提供新的分子靶點(diǎn)和策略。

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