阿托伐他汀對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用

張國(guó)欣 薛蘭芬 聶麗敏 王蕾 潘志蘭 許靜

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病的共同特征，是進(jìn)展至終末期腎病的共同通路［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)建立腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，并進(jìn)行藥物干預(yù)，通過(guò)免疫組織化學(xué)、病理組織學(xué)檢查等方法檢查肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)在腎小管間質(zhì)的表達(dá)情況及用藥后的變化，進(jìn)一步了解他汀類藥物的腎保護(hù)作用機(jī)制，為腎間質(zhì)纖維化的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 阿托伐他汀鈣片(立普妥，進(jìn)口注冊(cè)證號(hào):H2030119，10 mg/片，Godeck GmbH生產(chǎn)，輝瑞制藥有限公司分裝)。兔抗大鼠HGF多克隆抗體。SP免疫組化試劑盒。以上均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:清潔級(jí)健康雄性 Wistar大鼠54只(購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重180～220 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、阿托伐他汀治療組(C組)，每組18只。每組又因于術(shù)后第3、7、14天分批處死而分為N3、N7、N14組，每組6只。

1．2．2 動(dòng)物模型建立:術(shù)前空腹12 h，予 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后。下腹正中切口2．5 cm暴露左側(cè)腎臟，分離左側(cè)輸尿管，于中上1/3處結(jié)扎并剪斷，使左腎完全梗阻，后逐層縫合。A組開(kāi)腹后只游離輸尿管，不結(jié)扎。

1．2．3 給藥方法:于術(shù)前3 d開(kāi)始灌胃。C組給予阿托伐他汀(10 mg·kg－1·d－1，溶于 0．9% 氯化鈉溶液，制成混懸液)，A組及B組給予等量0．9%氯化鈉溶液灌胃。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食水。

1．2．4 標(biāo)本收集與制備:分別于術(shù)后第3、7、14天斷頭處死。留取血標(biāo)本2 ml，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)。迅速切取左腎，去除包膜，按冠狀位縱行剖開(kāi)，置于10%中性甲醛中固定。48 h后行石蠟包埋，將腎組織切成5μm切片，行HE、Masson及免疫組織化學(xué)染色。

1．2．5 生化檢查:血標(biāo)本采用日本Olympus AU-2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血TC。

1．3 病理檢查

1．3．1 組織固定、脫水、滲蠟、包埋:組織塊置于10%中性甲醛中，固定48 h，不同濃度的乙醇梯度脫水各2 h，其中95%2次，無(wú)水乙醇脫水3次，各30 min。二甲苯脫乙醇3次，各30 min。石蠟浸入3次，分別為30 min、30 min、1 h。石蠟冷卻包埋。

1．3．2 載玻片的處理:載玻片經(jīng)硫酸洗液浸泡24 h以上，95%乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗3～5次，將載玻片整齊排好，在烤箱中烤干。用純丙酮以1:150稀釋粘合劑 APES，將載玻片浸入其中1～2 min，取出低溫(37℃)烤干。

1．3．3 切片:應(yīng)用切片機(jī)，厚度為5μm，切片后于37℃恒溫箱中過(guò)夜。

1．3．4 石蠟切片脫蠟至水:二甲苯脫石蠟2次，各15 min，無(wú)水乙醇浸入2次，各10min，95%、80%、70%、60%、50%乙醇浸入各2 min，自來(lái)水、蒸餾水反復(fù)沖洗。

1．3．5 HE染色:脫蠟至水的切片浸入蘇木素3 min，水洗。1%鹽酸乙醇分化片刻，水洗。1%氨水溶液藍(lán)化片刻，水洗。0．5%伊紅乙醇浸染3 min。70%乙醇1 min，取出甩干，80%乙醇1min，取出甩干，95%乙醇1 min，3個(gè)無(wú)水乙醇各2 min，3個(gè)二甲苯各2 min。最后樹膠封片。

1．3．6 Masson染色:切片常規(guī)脫蠟至水(同HE染色)，置于麗春紅染液2 min，入2%冰醋酸水溶液2 min，入5%磷鉬酸水溶液煤染2 min，再入2%冰醋酸水溶液2 min，甲基綠染色3 min，自來(lái)水沖洗。95%乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

綠色為膠原纖維，在高倍鏡(×200)下隨即選擇15個(gè)不含腎小球及血管的腎皮質(zhì)視野，以腎間質(zhì)面積占一個(gè)視野場(chǎng)面積的百分比作為相對(duì)間質(zhì)容積值。

1．3．7 免疫組織化學(xué)染色(采用SP法):①5μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水(同HE染色)。②新鮮配置的3%H2O2孵育10～15 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。③蒸餾水沖洗3次，畫蠟邊。④抗原修復(fù)，采用水煮法。切片放入盛有抗原修復(fù)液(0．1 mol/L 的 PBS，pH 值 7．2 ～7．4)的小燒杯中，并將燒杯置于盛有自來(lái)水的大燒杯中，電爐上加熱煮沸。從小燒杯的溫度到達(dá)98～99℃起開(kāi)始計(jì)時(shí)20 min。⑤用1%BSA(小牛血清白蛋白)封閉，室溫孵育10～15 min(封閉組織內(nèi)電荷)，傾去血清，勿洗。⑥滴加1/50稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。⑦PBS沖洗5 min，3遍。⑧滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育60 min。⑨PBS沖洗 5 min，3遍。⑩滴加 SP復(fù)合物，37℃孵育 30～40 min。〇11PBS 沖洗 5 min，3 遍。〇12顯色:PBS 4 m l、DAB 5 g、H2O25μl，顯色5 min左右(以鏡下適度為好)。〇13自來(lái)水沖洗5次。〇14蘇木素復(fù)染1 min，水洗，1%鹽酸酒精分化，脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

采用1%BSA代替一抗的組織切片作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。光鏡下陽(yáng)性反應(yīng)部位為棕黃色。應(yīng)用真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)通過(guò)光學(xué)顯微鏡攝入圖像，放大200倍，每例切片隨機(jī)選取15個(gè)不含腎小球和小血管的腎皮質(zhì)視野，測(cè)定陽(yáng)性著色部位的總積分光密度值，并取其平均值為腎小管間質(zhì) ICAM-1、P-選擇素、NF-κB、ColⅢ表達(dá)的陽(yáng)性面積與著色強(qiáng)度綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析并對(duì)相關(guān)系數(shù)r進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 TC的變化 C組單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠在阿托伐他汀的干預(yù)下，TC的變化與A組及B組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見(jiàn)表1。

表1 3組總膽固醇水平比較n=6，mmol/L，±s

表1 3組總膽固醇水平比較n=6，mmol/L，±s

時(shí)間 A組 B組 C組2．1 ±0．3 2．1 ±0．4 2．3 ±0．3術(shù)后第7 天 2．1 ±0．3 2．1 ±0．5 2．1 ±0．2術(shù)后第14天術(shù)后第3天2．1 ±0．5 2．1 ±0．3 2．2 ±0．5

2．2 腎組織形態(tài)學(xué)改變 經(jīng)HE、Masson染色，光鏡下觀察A組從第3天到第14天腎組織未見(jiàn)明顯病理改變。B組術(shù)后第3天開(kāi)始出現(xiàn)腎間質(zhì)水腫、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞扁平、腎間質(zhì)增寬的特征，腎小球未見(jiàn)明顯異常;術(shù)后第7天腎小管明顯擴(kuò)張，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞，偶見(jiàn)萎縮的腎小管;術(shù)后第14天梗阻側(cè)腎臟肉眼觀察:腎臟體積增大，顏色灰白，內(nèi)有渾濁的尿液，腎皮質(zhì)變薄，光鏡下可見(jiàn)彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化明顯，偶見(jiàn)腎小球硬化。C組與B組平行相比腎小管間質(zhì)病變程度明顯減輕，腎間質(zhì)相對(duì)面積明顯減少(P＜0．05)。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。見(jiàn)表2。

表2 3組腎間質(zhì)纖維化結(jié)果半定量分析n=6，±s

表2 3組腎間質(zhì)纖維化結(jié)果半定量分析n=6，±s

注:與A組比較，*P ＜0．05;與術(shù)后3 d比較，#P ＜0．05;與B組比較，△P＜0．05

組別 術(shù)后第3天 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天A組0．020 ±0．003 0．021 ±0．005 0．023 ±0．004 B 組 0．323 ±0．014* 0．520 ±0．080*# 0．662 ±0．021*#C 組 0．276 ±0．006＊△ 0．380 ±0．005＊△ 0．455 ±0．004＊△

2．3 免疫組化結(jié)果 HGF在腎小管間質(zhì)A組各時(shí)期均幾乎無(wú)表達(dá)。在B組、C組主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)有少量表達(dá)，3 d時(shí)HGF表達(dá)較正常輕度增高，7 d時(shí)表達(dá)至高峰，14 d時(shí)表達(dá)減少(P＜0．05)。C組與B組同時(shí)相點(diǎn)比較，HGF的表達(dá)均增高，組間、組內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見(jiàn)表 3。

表3 3組HGF免疫組化結(jié)果n=6±s

表3 3組HGF免疫組化結(jié)果n=6±s

注:與A組比較，*P ＜0．05;與術(shù)后3 d比較，#P ＜0．05;與B組比較，△P ＜0．05

組別 術(shù)后第3天 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天A組29±5 26±9 30±7 B組 42±10* 125±7＊△ 35±8＊△C組 51±10*# 144±13*# 52±6*#

3 討論

近年來(lái)他汀類藥物的非依賴降脂的腎保護(hù)作用被不斷發(fā)現(xiàn)，Yamasthita等［2］研究表明，西立伐他汀通過(guò)抑制腎纖維化，降低尿蛋白來(lái)延緩由高血壓誘導(dǎo)的腎損害。Jandeleit-Dahm等［3］給予5/6腎切除大鼠阿托伐他汀治療12周，在未影響血脂和腎功能的情況下，發(fā)現(xiàn)大鼠尿蛋白減少，腎組織中TGF-β基因表達(dá)下調(diào)，腎小球及腎小管中單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。

腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病發(fā)展的共同結(jié)局。大量形態(tài)學(xué)定量分析認(rèn)為它是決定預(yù)后的重要因素，其病理過(guò)程起初是炎癥期，以淋巴、單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管變性損傷，繼而腎間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量基質(zhì)蛋白，間質(zhì)纖維化［4］。HGF作為近期研究最熱的抑制纖維化因子，在腎臟中作用靶點(diǎn)較多，其可與TGF-β1的互逆作用，進(jìn)而達(dá)到抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)［5］。本實(shí)驗(yàn)即采用UUO大鼠造成腎間質(zhì)纖維化，模擬人體內(nèi)的纖維化過(guò)程，研究阿托伐他丁對(duì)腎臟的保護(hù)作用。UUO術(shù)后第3天，腎小管開(kāi)始擴(kuò)張，即可觀察到HGF表達(dá)增加術(shù)后第7天，腎小管明顯擴(kuò)張，HGF表達(dá)明顯增加到術(shù)后第14天，HGF表達(dá)均明顯下降，并伴有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量沉積，腎小管萎縮，刷狀緣脫落，而腎小球基本未受影響。治療組較對(duì)照組HGF表達(dá)增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明HGF在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。在UUO模型中HGF表達(dá)顯著增高，抑制了腎間質(zhì)纖維化，阿托伐他汀促進(jìn)了HGF的高表達(dá)，減輕腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腎間質(zhì)纖維化，對(duì)腎臟有一定的保護(hù)作用。阿托伐他汀對(duì)HGF的抑制作用是獨(dú)立于降脂之外的。

1 Wynn TA．Cellular and molecularmechanisms of fibrosis．The Journal of Pathology，2007，214:199-210．

2 Yamashita T，Kawashima S，Miwa Y，et al．A 3-hydroxy-3-methylglutarylco-enzyme A reductase inhibitor reduces hypertensive nephrosclerosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats．JHypertens，2002，20:2465-2473．

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5 郭華，鄒萬(wàn)忠．腎小管間質(zhì)纖維化與單核巨噬細(xì)胞的關(guān)系．北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，35:503-507．