腸道病毒71型分子生物學(xué)研究進(jìn)展

劉麗艷,朱啟镕

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院,上海201102

腸道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)自1974年首次報(bào)道以來,其感染已在世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)與流行[1-9]。EV71主要引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD),在臨床上與柯薩奇病毒A16所致的HFMD難以區(qū)分,也能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的嚴(yán)重疾病。近年來,EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì),其中最令人關(guān)注的是該地區(qū)的EV71感染出現(xiàn)越來越嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。但其產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的機(jī)制、病毒結(jié)構(gòu)特征與毒力的關(guān)系目前還不明確,且缺乏有效預(yù)防其感染的疫苗。本文就此對(duì)EV71的分子生物學(xué)特征、分子流行病學(xué)及疫苗的研究進(jìn)展等作一綜述。

1 EV71的結(jié)構(gòu)特征

EV71是小RNA病毒科(picornaviridae)腸道病毒屬成員。病毒顆粒為二十面體立體對(duì)稱的球形結(jié)構(gòu),無包膜和突起,直徑24～30 nm,核酸為單股正鏈RNA。病毒顆粒的衣殼由60個(gè)亞單位構(gòu)成,后者由4種衣殼蛋白(VP1～VP4)拼裝成五聚體樣結(jié)構(gòu)。4種結(jié)構(gòu)蛋白中,除VP4包埋在病毒顆粒外殼的內(nèi)側(cè)并與病毒核心緊密連接外,其他3種均暴露在病毒顆粒表面,因而抗原決定簇基本上位于VP1～VP3[10]。病毒顆粒沒有類脂性的包膜,對(duì)去污劑、乙醚、脫氧膽酸鹽和弱酸有抵抗力。此外,該病毒還能抵抗75%乙醇和5%甲酚皂溶液等常見的消毒劑。這些都決定了該病毒有較強(qiáng)的存活能力。EV71對(duì)高溫(>50 ℃)及紫外線的抵抗能力較差。

EV71基因組為7 408個(gè)核苷酸組成的單股正鏈RNA,病毒基因組具有感染性?；蚪M僅有1個(gè)開放讀碼框架(open reading frame,ORF),編碼含2 193個(gè)氨基酸的聚合蛋白,其兩側(cè)為5′和3′非編碼區(qū)(untranslated region,UTR),3′ UTR含有長(zhǎng)度可變的聚合腺苷酸尾巴〔poly(A)〕,5′端共價(jià)結(jié)合1個(gè)小相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的蛋白(VPg)。聚合蛋白可進(jìn)一步水解成P1、P2、P3前體蛋白,P1前體蛋白可進(jìn)一步降解成VP1、VP2、VP3和VP4病毒衣殼蛋白。根據(jù)病毒衣殼蛋白VP1核苷酸序列的差異,可將EV71分為A、B、C基因型。目前除A基因型只有EV71原型株(BrCr株)外,B、C基因型又分別分為B1～B5、C1～C5亞型。P2和P3前體蛋白編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,包括2A(非特異性蛋白水解酶)、2B、2C、3A、VPg(5′端結(jié)合蛋白)、3C(特異性蛋白水解酶)和3D(RNA聚合酶組分)。病毒RNA正鏈和負(fù)鏈的5′和3′UTR中分別含有多肽翻譯的起始信號(hào)和RNA合成起始信號(hào)。5′ UTR通常折疊成多個(gè)特異性的空間結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)通過與宿主細(xì)胞蛋白因子的結(jié)合,在起始病毒基因組RNA的合成和蛋白翻譯過程中發(fā)揮重要作用。此外,5′ UTR結(jié)構(gòu)還涉及病毒的宿主范圍以及毒力等多個(gè)方面的功能。3′ UTR和poly(A)的功能目前尚不清楚。

2 EV71的毒力研究

EV71最初分離于有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者[1],可引起腦膜腦炎、腦干腦炎等嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀而導(dǎo)致死亡,也可引起皰疹性咽峽炎和HFMD等輕癥疾病。因此,大量研究試圖闡明EV71感染導(dǎo)致不同臨床癥狀的機(jī)制。目前分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),EV71感染引起的臨床癥狀與病毒的基因型并無關(guān)聯(lián),即不同基因型的毒株均可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)感染或輕微的臨床癥狀[7,11-15]。用3種基因型的EV71分別感染短尾猴,均出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,說明各型毒株均具有神經(jīng)系統(tǒng)毒性[16]。但部分研究發(fā)現(xiàn),C1亞型毒株主要分離自無并發(fā)癥的HFMD患者[12]或無癥狀者[17],認(rèn)為C1毒株的VP1第170位氨基酸突變(A→V)[12]和5′ UTR與聚合酶編碼基因的突變[17]是引起其毒力降低的原因。

EV71也是常見的致急性遲緩性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)的非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒(non-polio enterovirus,NPEV)[18],因此推測(cè)EV71與脊髓灰質(zhì)炎病毒具有相似的基因特征。脊髓灰質(zhì)炎病毒的5′ UTR和VPl區(qū)存在對(duì)其神經(jīng)毒性有決定作用的序列位點(diǎn),但長(zhǎng)期以來沒有在EV71的5′ UTR和VPl序列中找到與毒力直接相關(guān)的位點(diǎn)[19]。通過對(duì)EV71和脊髓灰質(zhì)炎病毒全基因組序列分析、比較發(fā)現(xiàn),2種病毒的核苷酸和氨基酸序列存在較大差異(全基因組核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為58%和55%),EV71與預(yù)測(cè)的脊髓灰質(zhì)炎病毒宿主受體結(jié)合蛋白的編碼區(qū)也不具有相似性,且在全基因組也未發(fā)現(xiàn)高度相似區(qū)[20],提示EV71組織嗜性和神經(jīng)毒力決定機(jī)制可能不同于脊髓灰質(zhì)炎病毒。然而,由于研究?jī)H限于對(duì)VPl區(qū)和5′ UTR序列的毒力分析,尚未通過定點(diǎn)突變進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,因此目前對(duì)EV71致AFP的毒力位點(diǎn)尚無定論。

其中，K為鄰居列表的長(zhǎng)度，若數(shù)據(jù)集較小，K可以與數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量相同；若數(shù)據(jù)集較大，可以只取前K個(gè)鄰居組成列表，以平衡算法復(fù)雜度和結(jié)果精確度。當(dāng)二階鄰近距離應(yīng)用于t-SNE算法時(shí)，K可與t-SNE算法中的近似參數(shù)配合。

另外,柯薩奇病毒Al6和EV71的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性分別為77%和89%,其主要臨床癥狀也與EV71相同,為HFMD。但柯薩奇病毒Al6感染在臨床上較少表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。EV71和柯薩奇病毒A16感染的不同臨床表現(xiàn)是否是因?yàn)榇嬖谏窠?jīng)毒性序列,目前尚無證據(jù)。研究還發(fā)現(xiàn),EV71與其他腸道病毒一樣,也存在重組現(xiàn)象[21-23],但與毒力關(guān)系還不清楚。對(duì)于點(diǎn)突變和重組這2種進(jìn)化方式與EV71毒力之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

3 流行病學(xué)

自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)EV71,已有3次EV71引起的大范圍HFMD流行。第1次流行高峰于1971～1980年,發(fā)生在美國(guó)、澳大利亞、日本、瑞典、保加利亞、匈牙利和法國(guó)等歐美國(guó)家。1975年在保加利亞流行期間共有705例患兒感染,149例發(fā)生AFP,44例死亡[11]。第2次流行于1985年開始,在中國(guó)香港和臺(tái)灣地區(qū)以及美國(guó)、巴西等地流行。第3次流行從1997年開始,在亞太地區(qū)大規(guī)模流行,如1997、2000和2003年在馬來西亞流行。其中1997年馬來西亞發(fā)生EV71大流行時(shí),4～8月有2 628例發(fā)病,僅4～6月就有29例死亡;1998～2001年在新加坡流行,其中2000年9、10月報(bào)告HFMD病例達(dá)3 790例,死亡5例。

社會(huì)的需要是檢驗(yàn)畢業(yè)設(shè)計(jì)質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。研究制訂適合新工科背景的教學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，及時(shí)了解企業(yè)與市場(chǎng)的動(dòng)態(tài)化需求，做好與畢業(yè)生的交流與反饋工作，開展多維度的畢業(yè)設(shè)計(jì)教學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)等的，是進(jìn)一步提高畢業(yè)設(shè)計(jì)質(zhì)量的階梯。

我國(guó)自1981年在上海始見HFMD后,北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、西寧、廣東等十幾個(gè)省(市)均有HFMD病例報(bào)道。1998年在我國(guó)臺(tái)灣省暴發(fā)了EV71引起的HFMD和皰疹性咽峽炎。在6月和10月的2波流行中,共監(jiān)測(cè)到129 106例病例,其中重癥病例405例,死亡78例,大多數(shù)為5歲以下的兒童,并發(fā)癥包括腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性軟癱和心肌炎。2000年5～8月在山東省招遠(yuǎn)市暴發(fā)了HFMD,市人民醫(yī)院接診患兒1 698例,其中年齡最小為5個(gè)月,最大14歲,3例合并暴發(fā)性心肌炎而死亡。2007年,全國(guó)共報(bào)告HFMD病例83 344例,死亡17例。僅山東省就報(bào)告了HFMD病例39 606例,北京、上海等大城市也有上萬例HFMD的病例報(bào)告。2008年3月HFMD在安徽阜陽暴發(fā)并迅速蔓延到很多省份,當(dāng)年全國(guó)共有488 955例,死亡126例。2009年疫情來得更兇猛、更嚴(yán)重,截至7月5日,僅山東省的累計(jì)報(bào)告病例就達(dá)85 301例,累計(jì)報(bào)告死亡病例44例。EV71感染導(dǎo)致的疾病給家庭和社會(huì)造成了沉重負(fù)擔(dān)。

4 疫苗研究

雖然滅活病毒疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答強(qiáng)度高于亞單位疫苗,但滅活疫苗存在安全性問題,尤其在免疫功能缺陷者尤為引人注意,因此有研究者探索了安全性更高的病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)的免疫效果。Chung等[25]分別把純化EV71 VLP、變性EV71 VLP和熱滅活EV71免疫BALB/c小鼠,比較三者的免疫效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化EV71 VLP與其他兩者可產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目侷gG水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外,純化EV71 VLP可刺激產(chǎn)生更高的中和抗體,且所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能更好地保護(hù)新生小鼠(在接受1 000 LD50病毒攻擊時(shí),純化EV71 VLP組新生小鼠的存活率為89%,變性EV71 VLP組和熱滅活EV71組新生小鼠的存活率分別為45.5%和57.9%)。雖然,EV71 VLP具有良好的免疫效果,但要獲得大量的VLP并進(jìn)行大規(guī)模的純化,目前還存在一定困難。

有效疫苗是預(yù)防傳染病的最重要措施。目前已對(duì)EV71疫苗進(jìn)行了大量研究。Wu等[24]比較了滅活病毒疫苗、VPl DNA疫苗和重組VPl蛋白亞單位疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生及對(duì)哺乳期小鼠的保護(hù)作用。滅活病毒疫苗免疫母鼠所產(chǎn)新生鼠接受2 300 LD50病毒攻擊時(shí)仍有80%可存活,而VPl DNA疫苗和重組VPl蛋白亞單位疫苗僅在新生鼠接受230 LD50時(shí)顯示保護(hù)作用。在接受230 LD50病毒攻擊時(shí),VPl DNA疫苗免疫母鼠所產(chǎn)新生鼠的存活率為40%,重組VPl蛋白亞單位疫苗組為80%。3種疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答也存在差異:滅活病毒疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4),DNA疫苗組產(chǎn)生高水平的γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和IL-12,而VPl蛋白亞單位疫苗組則以產(chǎn)生IL-10和IFN-γ為主。總體來看,滅活病毒疫苗能誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的體液免疫,且所產(chǎn)生的抗體被動(dòng)傳遞給新生小鼠后能發(fā)揮更好的保護(hù)作用。

也有學(xué)者嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因技術(shù)來開發(fā)EV71疫苗。2006年,Chen等[26]構(gòu)建了VPl 基因表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)化至番茄。新鮮番茄汁中VPl蛋白量可達(dá)27 μg/g,將含有VPl蛋白的番茄汁作為口服疫苗接種BALB/c小鼠,可使小鼠產(chǎn)生VPl特異性IgA和IgG,且小鼠血漿能中和EV71,小鼠脾細(xì)胞也表現(xiàn)出增殖反應(yīng)。Chen等[27]于2008年培育出VP71轉(zhuǎn)基因小鼠,其分泌的乳汁中重組VPl蛋白含量可達(dá)2.51 mg/ml,經(jīng)含VPl蛋白乳汁喂養(yǎng)的小鼠可產(chǎn)生EV71特異性抗體。因此,轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能為EV71疫苗的研發(fā)開辟新途徑。

2016年以后，國(guó)內(nèi)旅游者行為研究發(fā)生了新的轉(zhuǎn)向，研究?jī)?nèi)容呈現(xiàn)多樣化的發(fā)展特點(diǎn)。在研究?jī)?nèi)容上，借鑒倫理學(xué)、社會(huì)學(xué)、人類學(xué)等相關(guān)理論，深化了對(duì)旅游者不文明行為的探討；對(duì)旅游者的風(fēng)險(xiǎn)感知、具身體驗(yàn)研究逐步深入；旅游流動(dòng)性的研究新視角不斷發(fā)展深入，朝著學(xué)科交叉、跨文化研究的方向推進(jìn)。但是，對(duì)于旅游者與社區(qū)居民的互動(dòng)、社區(qū)居民的心理變化等的相關(guān)研究一直停滯不前，研究成果較少。在研究方法上，逐步實(shí)現(xiàn)了定量與定性分析的結(jié)合，能夠運(yùn)用田野調(diào)查、深度訪談等方法展現(xiàn)研究結(jié)果的科學(xué)性。但是，旅游者行為研究的理論概念、研究范式和學(xué)科體系尚未構(gòu)建完全，未來需進(jìn)一步完善旅游者行為研究的理論框架。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前EV71感染仍是全球危害兒童較大的病毒性疾病之一,特別是近年來在東南亞,其危害越來越大。目前病毒結(jié)構(gòu)與毒力的關(guān)系尚不清楚,缺乏有效預(yù)防EV71感染的疫苗。因此,該病毒分子流行病學(xué)的檢測(cè)、病毒結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究是當(dāng)前的重要任務(wù),加快疫苗的研發(fā)以控制EV71感染的暴發(fā)和流行刻不容緩。

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