FHIT基因微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌的關(guān)系

王喜英，趙富璽，孟 健，劉潤(rùn)花，

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西大同037009)

脆性組氨酸三聯(lián)體基因 (fragile histidine triad,FHIT)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,位于3P14.2區(qū)域,該基因跨越人類(lèi)染色體脆性部位FRA3B和家族性腎細(xì)胞癌相關(guān)的染色體交叉易位斷裂點(diǎn),它是第一個(gè)將染色體脆性易位點(diǎn)與腫瘤相聯(lián)系的分子生物學(xué)證據(jù).在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡中發(fā)揮作用[1].已有研究發(fā)現(xiàn)該基因與多種腫瘤如食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān).國(guó)內(nèi)有關(guān)FHIT與宮頸癌及人乳頭瘤病毒 (Human Papillomavirus,HPV)感染的研究還很少.本文對(duì)50例浸潤(rùn)性宮頸癌及40例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 (Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)組織進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Midrosatellite instability,MI)及HPV感染的檢測(cè),旨在探討FHIT基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其與HPV感染的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

取2006年3月-2009年3月山西省腫瘤醫(yī)院病理科石蠟存檔樣本為研究對(duì)象.其中CIN 40例,CINⅠ12例、CINⅡ13例、CINⅢ10例、原位癌5例,患者年齡23～68歲,中位年齡42歲;原發(fā)性浸潤(rùn)癌50例,患者年齡28～74歲,中位年齡53歲;另有鱗癌45例、腺癌5例.取正常宮頸組織20例為對(duì)照.所有病例的診斷均經(jīng)病理檢查確診,所有癌癥病例取材前均未行任何特殊治療.

1.2 抽提DNA

每例樣本各取10 μm石蠟切片,常規(guī)蛋白酶K消化,酚-氯仿-異戊醇抽提癌組織及正常組織DNA,用乙醇沉淀DNA,TE(Tris-Hcl和EDTA)緩沖液溶解后,-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 樣本組織微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增及LOH、MI判定

選取位于FHIT內(nèi)的兩個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)D3S1234和D3S4103,引物序列(見(jiàn)表1)來(lái)自 Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù),由日本Takara公司合成.50 μL反應(yīng)體系中含DNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,10×buffer 5 μL,MgCL23 μL,dNTP 5 μL,TaqDNA聚合酶1 U,去離子水補(bǔ)至50 μL,石蠟油覆蓋.PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,后D3S1234按94℃30 s,62℃30 s,72℃45 s順序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸5 min;D3S4103按94℃90 s,56℃90 s,72℃60 s順序擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 min.

表1 微衛(wèi)星DNA標(biāo)志引物序列、HPVPCR引物序列及相關(guān)參數(shù)

圖1 D3S1234、D3S4103位點(diǎn)MI

10 μL PCR產(chǎn)物加2 μL上樣緩沖液,混合均勻,上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠120 V電泳1 h 50 min后,銀染,白熾燈下觀察結(jié)果.結(jié)果判斷:若腫瘤組織與相應(yīng)正常組織對(duì)比,條帶增多,位置改變或濃度增加判為MI[2](圖1).

1.4 樣本組織HPV PCR擴(kuò)增和電泳

HPV16型E6基因引物的序列(見(jiàn)表1)由日本Takara公司合成.PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性8 min,后按94℃30s,50℃30 s,72℃1 min順序擴(kuò)增40次循環(huán)后,72℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下觀察(圖2).

圖2 宮頸癌中HPV PCR結(jié)果

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn).

2 結(jié)果

2.1 MI分析

浸潤(rùn)性宮頸癌在D3S1234和D3S4103位點(diǎn)上MI發(fā)生頻率分別為18%(9/50)、14%(7/50).CIN在D3S1234和D3S4103位點(diǎn)上MI發(fā)生頻率分別為12.5%(5/40)、7.5%(3/40).其中,在 D3S1234 位點(diǎn)上低級(jí)別CIN(CINⅠ,Ⅱ)和高級(jí)別CIN(CINⅢ,原位癌)的MI發(fā)生頻率分別為12%(3/25)、13.3%(2/15).在D3S4103位點(diǎn)上低級(jí)別CIN(CINⅠ,Ⅱ)和高級(jí)別CIN(CINⅢ,原位癌)的MI陽(yáng)性率分別為16%(4/25)、20%(3/15).隨CIN級(jí)別的增加MI陽(yáng)性率呈逐漸遞增趨勢(shì).宮頸癌和CIN發(fā)生MI的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但宮頸癌MI發(fā)生率均高于CIN.

45例鱗狀細(xì)胞癌中在D3S1234位點(diǎn)上發(fā)生MI的頻率為22.2%(10/45);在D3S4103位點(diǎn)上發(fā)生MI的頻率為32%(8/45).5例腺癌中在D3S1234位點(diǎn)上有2例發(fā)生MI;在D3S4103位點(diǎn)上也有2例發(fā)生MI.差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).

但腺癌組織中MI發(fā)生率高于鱗癌組織.

2.2 HPV16感染狀況

50例浸潤(rùn)性宮頸癌組織中,HPV感染陽(yáng)性患者為44例,占88%(44/50).CIN中HPV感染的頻率為42.5%(17/40),而正常組中僅為5%(10/20).隨著臨床分期和組織學(xué)分級(jí)的增加,HPV感染率增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.CIN組中,低分化CIN感染率為24%(6/25),高分化CIN感染率為73.3%(11/15),且P＜0.05.

2.3 HPV16感染與MI的關(guān)系

數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.宮頸癌中HPV感染的陽(yáng)性、陰性樣本在MI的發(fā)生率上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CIN中HPV感染的陽(yáng)性、陰性樣本MI的發(fā)生率差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表2 MI與HPV的關(guān)系

3 討論

MI是由DNA復(fù)制錯(cuò)誤引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的改變,表現(xiàn)為腫瘤組織與其相應(yīng)的非腫瘤組織DNA結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的異常改變揭示基因的不穩(wěn)定性,造成某些腫瘤抑制基因的失活,導(dǎo)致細(xì)胞增殖及分化異常,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[3].

實(shí)驗(yàn)選取位于FHIT基因2個(gè)重要結(jié)構(gòu)功能區(qū)外星子5和8附近的微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行MI分析,同時(shí)檢測(cè)HPV16的感染狀況,發(fā)現(xiàn)宮頸癌中FHIT基因在D3S1234位點(diǎn)的MI為18%,在D3S4103位點(diǎn)為14%,這與其他學(xué)者研究的結(jié)果相似[4].Hendyick等研究發(fā)現(xiàn)63%宮頸癌細(xì)胞系可檢出異常的FHIT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,包括多個(gè)外顯子缺失.同時(shí)發(fā)現(xiàn),一部分受累細(xì)胞系的FHIT等位基因發(fā)生了改變.實(shí)驗(yàn)提示宮頸癌患者的FHIT基因存在異常,在宮頸癌發(fā)生過(guò)程中有相應(yīng)的缺失,同時(shí)存在突變.而且發(fā)現(xiàn)腺癌MI的發(fā)生率40%高于鱗癌22.2%,說(shuō)明MI在宮頸腺癌中更具有特異性.

FHIT基因的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中是一個(gè)誘發(fā)因子還是一個(gè)后期事件,各家的看法不一.Wistuba[5]通過(guò)對(duì)宮頸癌組織、CIN及正常宮頸組織研究推測(cè)FHIT基因異?？赡懿皇遣∽兊脑缙谑录?而與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān).Lonnolly[6]發(fā)現(xiàn),FHIT基因在正常宮頸組織和早期CIN中均有廣泛表達(dá),而在71%宮頸癌和52%CIN中FHIT基因表達(dá)顯著降低,因此推測(cè)FHIT異常是后期事件.Veuhione[7]等檢測(cè)131例宮頸刮片,發(fā)現(xiàn)FHIT基因在正常細(xì)胞中表達(dá)正常,而在發(fā)育不良的細(xì)胞中表達(dá)減少,亦顯示FHIT表達(dá)丟失發(fā)生在宮頸癌變過(guò)程的早期.據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)顯示,CIN在D3S1234點(diǎn)MI發(fā)生率為12.5%,在D3S4103發(fā)生率為7.5%，與宮頸癌在兩個(gè)位點(diǎn)上的MI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但高級(jí)別CIN患者的MI高于低級(jí)別的CIN患者.因此我們推測(cè)FHIT基因的改變?cè)趯m頸癌的各個(gè)階段都有發(fā)生,但在CIN后期發(fā)生率多一些.

已經(jīng)明確HPV16是宮頸癌的致病因素,HPV16進(jìn)入細(xì)胞后將其DNA整合于3號(hào)染色體的脆性部位即FRA3B處,而在FHIT基因起始編碼外顯子E5的著絲粒側(cè)也發(fā)現(xiàn)了HPV16的整合點(diǎn)[8]．Butler[9-10]等研究發(fā)現(xiàn),FHIT基因與HPV16感染有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.本研究中,FHIT基因的MI陽(yáng)性率不高,表明MI不是宮頸癌中FHIT基因失活的主要機(jī)制;但宮頸癌和CIN中,HPV感染的陽(yáng)性組MI的發(fā)生率均高于陰性組,表明MI與HPV的感染存在一定的相關(guān)性.

目前FHIT基因的功能及作用機(jī)制仍未完全明確,許多問(wèn)題尚待闡明.今后的深入研究將進(jìn)一步揭示FHIT基因在腫瘤發(fā)生中的具體機(jī)制及其與其他癌基因、抑癌基因和病毒感染的關(guān)系.FHIT基因有望成為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的敏感標(biāo)志物,并用于腫瘤的早期診斷及預(yù)后分析．

[1]Roz L,Andriani F,Ferreira C G,et al.The apoptotic pathway triggered by the FHIT protein in lung cancer cell lines is not affected by bcl-X(L)overexpression[J].Oncogene,2004,23(56):9102-9110.

[2]Kiyoshi Y,Takayuki E,Takafumi N,et al.FHIT alterations in cancerous and non-cancerous cervical epithelium[J].Int J Cancer,2005,85(1):6-13．

[3]Blanes A,Diaz-Cano S J.Complementary analysis of microsatellite tumor profile and mismatch repair defects in colorectal carcinomas[J].World J Gastroenterol,2006,12(37):5932-5940.

[4]Huang L W,Chao S L,Chen T J.Reduced Fhit expression in cervicao carcinoma:correlation with tumor progression and poor prognosis[J].Gynecol Oncol,2003,90(2):331-337.

[5]Wistuba I I,Motellano F D,Milgbarub S,et al.Deletions of chromosome 3p are frequent and early events in the pathogenesis of uterine cervical carcinoma[J].Cancer Res,1997,57(15):3154-3158.

[6]Lonnolly D L,Greenspan D L,Wu R,et al.Lessof fhit expressinf in invasive cervical carcinomas and intraepithelial lesions associated with invasive disease[J].Clin Cancer Res,2000,6(9):3505-3510.

[7]Veuhione A,Eanesi N,Trombetta G,et al.Cervical dysplasia ploidy and human papillomavirus statis correlate with loss of Fhit expression[J].Chin Cancer Res,2001,7(51):1306-1312.

[8]Matthews C P,Shera K,Kiviat N,et al.Expression of truncated FHIT transcripts in cervical cancers and in normal human cells[J].Oncogene,2001,20(34):4665-4675.

[9]Butler D,Collins C,Mabruk M,et al.Deletion of the FHIT gene in neoplastic and invasive cervical lesions is related to high-risk HPV infection but is independent of histopathological features[J].Pathology,2000,192(4):502-510.

[10]Butler D,Collins C,Mabruk M,et al.Loss of FHIT espression as a poteneial marker of malignant progression in preinvasive aquarnous cervical cancer[J].Gynecol Oncol,2002,86(2):144-149.