香青蘭提取物對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

趙 杰,薛文華,梁淑紅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科鄭州 450052 2)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所烏魯木齊 830004△男,1969年5月生,博士,副主任藥師,研究方向:臨床藥理學(xué),E-mail:zhaojie@zzu.edu.cn

唇形科植物中的香青蘭分布于我國(guó)東北、西北及華北等地區(qū),特別是新疆,資源豐富。香青蘭藥用全草為地上干燥部分,氣清香,葉微辛。香青蘭在民間用于治療冠心病及血液質(zhì)旺盛(高血壓)、寒性神經(jīng)性頭痛等疾病,療效確切。冠心病是常見病和多發(fā)病,心絞痛為本病的主要癥狀之一。研究[1]發(fā)現(xiàn),香青蘭二級(jí)溫?zé)?有很強(qiáng)的香味,具有補(bǔ)益心腦、活血化淤、通路開竅及止痛解毒之功效,全方位針對(duì)治療冠心病和心絞痛的綜合癥狀,確實(shí)能改善心肌缺血的狀況。為了進(jìn)一步開發(fā)利用香青蘭,作者分別對(duì)香青蘭進(jìn)行了系統(tǒng)分層溶劑萃取,分別得到總提取物層、氯仿層、乙酸乙酯層和正丁醇層,然后用體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞制備缺氧/復(fù)氧(hypoxia/ reoxygenation,H/R)損傷模型,觀察香青蘭不同提取部位對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 香青蘭由新疆民族藥研究所提供;NaCl與KCl(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、KH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2和NaHCO3(天津市化學(xué)試劑三廠);EDTA、二甲基亞砜、MTT、DMEM培養(yǎng)粉(高糖、低糖)和胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司);胎牛血清、鏈霉素(華北制藥股份有限公司);注射用氨芐西林鈉(中諾藥業(yè)有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(美國(guó)Gibco公司)。超聲細(xì)胞破碎儀(上海新芝生物技術(shù)研究所與寧海新芝科研所生產(chǎn)),酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Coulter公司生產(chǎn))。

1.2 香青蘭有效成分的提取 香青蘭全草500 g,粉碎,分別用體積分?jǐn)?shù)為 95%的乙醇回流提取 2次和體積分?jǐn)?shù) 50%的乙醇回流提取 1次,料液體積比1:10,每次 2 h,合并 3次的提取液,減壓濃縮回收溶劑得浸膏 150 g。再對(duì)浸膏進(jìn)行分層萃取,具體流程參考文獻(xiàn)[2]。

1.3 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)[3]取出生 1～3 d的SD大鼠乳鼠(雌雄不限,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。無菌條件下取出心臟后用冷PBS溶液洗凈心臟內(nèi)殘血,將心肌剪碎成 1 mm3左右的小塊,用培養(yǎng)基沖洗2～3次后,置組織于2.5 g/L胰蛋白酶中37℃分次消化,每次 10m in,收集上清液并用冷的體積分?jǐn)?shù) 10%的胎牛血清終止消化,反復(fù)吹打使細(xì)胞游離。消化液移入消毒的刻度離心管中, 1 000 r/min離心10 min,收集心肌細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM懸浮,在37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)90min。以差速貼壁法去除已貼壁的成纖維細(xì)胞和其他雜質(zhì),將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,在 37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下密閉培養(yǎng),24 h后更換全部的培養(yǎng)液,以后每 2～3 d更換培養(yǎng)液 1次,于試驗(yàn)前 1 d換成無血清的培養(yǎng)基,待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)候開始實(shí)驗(yàn)。

1.4 H/R損傷模型的建立[4]不含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液用體積分?jǐn)?shù)99.9%氮?dú)怙柡?0 min后,置換培養(yǎng)瓶中的正常含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,再向瓶?jī)?nèi)充氮?dú)?1 L/m in) 90 s,以驅(qū)除瓶?jī)?nèi)氧氣。然后塞緊瓶塞,密閉培養(yǎng) 2 h后,換用經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 5%CO2飽和的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清正常含糖DMEM培養(yǎng)液,在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 min,建立H/R模型。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的細(xì)胞于加藥前 1 d移入96孔板,并分為 6組(每組 10孔)。①正常對(duì)照組含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。②模型組:缺氧 2 h,復(fù)氧30 min。③總提取物組。④氯仿組。⑤乙酸乙酯組。⑥正丁醇組。各提取物組均在H/R后 1 h后加入相應(yīng)提取物,然后置于37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中24 h。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)

1.6.1 細(xì)胞的存活情況 心肌細(xì)胞懸浮液以2× 106mL-1的密度接種于 96孔板,用含體積分?jǐn)?shù) 10%的胎牛血清培養(yǎng) 24 h后,用緩沖液沖洗2遍,后加入培養(yǎng)基和香青蘭的不同提取物,從單純培養(yǎng)液作對(duì)照,在37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)24 h后,每孔加20μL的MTT,37℃孵育4 h,吸去上清液,每孔加二甲基亞砜 100μL,振蕩數(shù)分鐘使其充分混勻,在酶聯(lián)檢測(cè)儀上于570 nm處測(cè)定吸光度(A)值。

1.6.2 細(xì)胞活力 取少量心肌細(xì)胞懸液以0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染料染色,著色細(xì)胞為死細(xì)胞,而活細(xì)胞拒染,在倒置顯微鏡下,用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)活細(xì)胞的數(shù)目和死細(xì)胞數(shù)。根據(jù)下式求細(xì)胞活力:細(xì)胞活力=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6.3 LDH活性 收集各組培養(yǎng)基,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定LDH釋放量。

1.6.4 細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量測(cè)定 MDA的測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法,SOD的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法,操作嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說明書步驟。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行分析,各組所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)方差齊性檢驗(yàn);然后采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 香青蘭提取物對(duì)H/R損傷的心肌細(xì)胞活力的影響 各組細(xì)胞活力和吸光度值均服從正態(tài)分布且總體方差齊,因此采用單因素方差分析,結(jié)果見表1。

表1 香青蘭提取物對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞活力的影響

2.2 香青蘭提取物對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞LDH、MDA和SOD活性的影響 各組LDH、MDA和SOD數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布且總體方差齊,因均采用單因素方差分析,結(jié)果見表 2。

表2 香青蘭提取物對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞LDH、M DA和SOD指標(biāo)活性的影響

3 討論

在細(xì)胞水平上,常以乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型模擬在體心肌缺血/再灌注損傷。作者在大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了心肌細(xì)胞H/R損傷的模型,心肌細(xì)胞缺氧 2 h,后復(fù)氧 30 min后,搏動(dòng)減弱甚至停止,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng),心肌細(xì)胞這些結(jié)構(gòu)和功能的改變與心臟缺血/再灌注損傷幾乎一致,可以較為真實(shí)的模擬缺血/再灌注損傷的病理生理過程[5]。

SOD是重要的抗氧化酶,其活性的高低反映心肌細(xì)胞抗氧化損傷的能力,MDA則是生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,其含量的變化反應(yīng)生物膜是否遭到過氧化損傷。缺氧時(shí)心肌細(xì)胞膜損傷,細(xì)胞膜的完整性遭到破壞,導(dǎo)致膜流動(dòng)性下降,通透性增加,心肌細(xì)胞LDH將大量外漏。因此,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD活性、MDA含量和培養(yǎng)液LDH的釋放量可以反映細(xì)胞的受損程度。

作者的結(jié)果顯示:缺氧/復(fù)氧模型組與正常組比較,SOD活性下降,MDA含量、LDH活性明顯增加,提示造模成功;香青蘭不同提取物給藥組與H/R模型組比較,SOD活性升高,MDA含量、LDH活性降低,說明香青蘭提取物具有抑制H/R所引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),保護(hù)心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的作用。氯仿組和乙酸乙酯組SOD活性升高,MDA含量、LDH活性降低,其他組之間相比較而言差異顯著,總提取物組與正丁醇組對(duì)此沒有明顯的作用。此外,該研究香青蘭氯仿組和乙酸乙酯組可顯著提高細(xì)胞的存活率,減輕 H/R所致的細(xì)胞損傷,提示這2個(gè)萃取部位含有某種化學(xué)物質(zhì)能夠減輕 H/R對(duì)組織的損傷。有研究[6]報(bào)道稱氯仿萃取部位和乙酸乙酯萃取部位含有大量的黃酮類物質(zhì),黃酮類物質(zhì)具有降血脂等治療心腦血管疾病的作用。以上說明香青蘭氯仿組和乙酸乙酯組可能是通過黃酮類物質(zhì)降低H/R對(duì)組織的損傷。MTT進(jìn)入活細(xì)胞,被氧化后形成藍(lán)色的結(jié)晶物,MTT法的A值即反應(yīng)心肌細(xì)胞的存活情況,又反應(yīng)心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性。該實(shí)驗(yàn)中,H/R損傷模型組的心肌細(xì)胞的A值明顯下降,而預(yù)先加入香青蘭提取物后,MTT結(jié)晶量明顯增加,也提示香青蘭提取物對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述:香青蘭的不同提取部位可以對(duì)抗 H/ R所引起的脂質(zhì)過氧化損傷,從而保護(hù)心肌細(xì)胞,尤其以氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位的作用最強(qiáng)。

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