人參皂甙Rg1和Rb1抗運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的實(shí)驗(yàn)研究

馮毅羽中 潘華山 卞伯高 趙自明 陳楚杰

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006;2.廣東省中醫(yī)研究所廣東廣州510095）

近年來，隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng) （CNS）生理學(xué)研究的深入，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在疲勞中的作用越來越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂是運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的重要原因之一。相關(guān)研究證實(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、代謝產(chǎn)物的變化都對(duì)機(jī)體產(chǎn)生主要影響[1]。而中醫(yī)認(rèn)為運(yùn)動(dòng)性疲勞的主要病機(jī)是氣虛陽弱，人參具有大補(bǔ)元?dú)庵?。本研究根?jù) “虛則補(bǔ)之”的基本原理，選用中藥人參提取物人參皂甙Rg1和Rb1，對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠進(jìn)行灌胃治療，考察大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺 （5-HT）、γ-氨基丁酸 （GABA）、多巴胺 （DA）和乙酰膽堿（Ach）含量的變化，探討人參皂甙Rb1和Re抗運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的效果和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，180～220g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK（粵）2008-0085，使用動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào):0031686。于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，動(dòng)物室內(nèi)溫度21～24℃，相對(duì)濕度40～55%，室內(nèi)空氣流通，光照時(shí)間l2 h。

1.2 藥品、主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)藥品人參皂甙Rg1和Rb1均由上海同田生物技術(shù)有限公司提供，臨用時(shí)用生理鹽水按0.1ml/kg體重配成合適濃度后給藥。5-HT、GABA、DA和Ach標(biāo)準(zhǔn)品，由AMRESCO公司提供;其它化學(xué)試劑均由廣州新康醫(yī)學(xué)試劑公司提供，均為分析純。上述所有試劑均在有效期內(nèi)使用。主要儀器有LC6A型島津高效液相色譜儀及其檢測(cè)器，ZH-PT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)機(jī)。

1.3 運(yùn)動(dòng)疲勞模型的復(fù)制與分組方法

40只雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為人參皂甙Rg1組 （50 mg/kg）、人參皂甙 Rb1組 （50 mg/kg）、模型組 （0.1ml/kg生理鹽水）和空白組 （等容量生理鹽水.），每天上午8時(shí)灌胃一次，1 h后將空白組放回籠中常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組均進(jìn)行中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的水平跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度為15 m/min，坡度0°，跑臺(tái)20 min，間歇40 min，再跑臺(tái)20 min，每天一次，連續(xù)14天。大鼠每?jī)商旆Q重一次，按照新體重調(diào)整灌胃量。

1.4 腦組織取材和勻漿制備

沿大鼠第一頸椎處剪斷脊髓，沿枕骨大孔與大鼠耳緣上連線處剪開顱腔，取完整全腦，用4℃生理鹽水清洗，濾紙吸干，立即置于放有冰塊的小盤內(nèi)，參照大鼠腦立體定位圖譜及文獻(xiàn)介紹，在冰面上迅速分離下丘腦，稱重后-180℃保存。從下丘腦取新鮮冰凍的腦組織，電子天平稱重，加冰冷的0.1mol/L高氯酸，冰浴下制備腦組織勻漿，4℃，14 000×g離心20 min，取上清液，0.2μ m濾膜濾過、分裝，-80℃冷藏。

1.5 腦組織中樞神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定

1.5.1 下丘腦5-HT和DA含量測(cè)定方法

C18柱 （4.6 mm ×250 mm ，5μ m），LC-10AD泵，SIL-10A自動(dòng)進(jìn)樣器，樣品量20μ L，流動(dòng)相∶甲醇∶水 =40∶60，含 0.028 g/L EDTANa2，0.15 g/L SDS，0.2ml/L H2SO4，pH:2.5-3;流速:1.0 mL/min;CTO:10AVP，柱溫18℃，壓力為160kgf/cm2。L-ECD-6A電化學(xué)檢測(cè)器，CLASS-LC10 VER1.63工作站，以每克腦組織中遞質(zhì)含量表示 （ng/g）。

1.5.2 下丘腦GABA含量測(cè)定方法

色譜條件:色譜柱:鋰柱10 cm×4.0 mm，柱溫:77℃，流動(dòng)相:鋰緩沖液，流速14 ml/h;茚三硐顯色劑，將二甲亞砜與茚三酮配制成茚三酮顯色劑，流速:10 ml/h，進(jìn)樣量:1000μ l，比色波長:570nm，GABA含量以每克下丘腦組織中GABA的量 （μ mol/g）表示。

1.5.3 下丘腦Ach含量測(cè)定方法

取上述制備的下丘腦勻漿上清液，以Na2HPO4（100 mmol/L）、5-HT四甲基氯化銨（0.5 mmol/L）、辛基磺酸鈉 （2.0 mmol/L）和0.005%“MB”試劑為流動(dòng)相，重蒸去離子水定容，磷酸 （85%）調(diào)pH值為8.00。色譜條件為:ESA582型二元泵體系、ESA ACH-3色譜柱 （150×3 mm I.D.）、進(jìn)樣量 10μ L、流速 0.35 mL/min。檢測(cè)條件為:5600A型電化學(xué)檢測(cè)器、ESA柱前酶反應(yīng)器、ESAACH-SPR、M5040型分析電極、鉑工作電極、固態(tài)鈀參比電極;電勢(shì)為+300 mV。結(jié)果以每克組織中Ach含量 （mg/g）表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用單因素方差分析，組間均值比較采用SNK法，方差不齊時(shí)組間均值兩兩比較采用Dunnett T3法。以上數(shù)據(jù)均由SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。α=0.05。

2 結(jié)果

各項(xiàng)結(jié)果見表1。

表1 人參皂苷對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠下丘腦各指標(biāo)含量的影響

2.1 人參皂甙Rg1和Rb1對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠下丘腦5-HT含量的影響

與模型組比較，空白組、人參皂甙 Rg1組和Rb1組下丘腦5-HT含量均有顯著降低 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦5-HT含量有顯著性降低 （P＜0.05）。

2.2 人參皂甙Rg1和Rb1對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠下丘腦GABA含量的影響

與模型組比較，空白組、人參皂甙 Rg1和Rb1組下丘腦GABA含量均有顯著降低 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦GABA含量有顯著性降低 （P＜0.05）。

2.3 人參皂甙Rg1和Rb1對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠下丘腦DA含量的影響

與模型組比較，人參皂甙Rg1組下丘腦DA含量有顯著性升高 （P＜0.05），空白組和Rb1組下丘腦DA含量均有顯著性升高 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦DA含量有顯著性升高 （P＜0.01）。

2.4 人參皂甙Rg1和Rb1對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠下丘腦Ach含量的影響

與模型組比較，空白組、人參皂甙 Rg1組和Rb1組下丘腦Ach含量均有顯著性升高 （均有P＜0.01）;與人參皂甙Rg1組比較，人參皂甙Rb1組下丘腦Ach含量有顯著性降低 （P＜0.05）。

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞與中樞神經(jīng)遞質(zhì)

神經(jīng)遞質(zhì)是一類在人體內(nèi)負(fù)責(zé)傳遞神經(jīng)信息的物質(zhì)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種神經(jīng)元間的信息傳遞是由這類物質(zhì)來完成的。關(guān)于中樞疲勞機(jī)制的一個(gè)重要學(xué)說是長時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)中樞神經(jīng)遞質(zhì)改變以及不同遞質(zhì) （興奮性和抑制性）之間相對(duì)平衡的破壞誘導(dǎo)了疲勞的發(fā)生[2]。新近的研究表明，運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生主要和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT與GABA、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA與Ach四種神經(jīng)遞質(zhì)的改變密切相關(guān)。其主要機(jī)制是:1）激烈長期運(yùn)動(dòng)時(shí)腦干和丘腦的5-HT明顯升高，激發(fā)倦怠、食欲不振、睡眠紊亂等疲勞癥狀[3]。主要原因是隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長血漿游離脂肪酸 （FFA）和支鏈氨基酸（BCAA）氧化增加，血漿中游離色氨酸 （f-Trp）的濃度相對(duì)上升，f-Trp/BCAA比值增加，進(jìn)而引起進(jìn)入腦內(nèi)的f-Trp增多，而f-Trp是合成腦5-HT的前體，故5-HT也隨之增加[4]。2）在長時(shí)間運(yùn)動(dòng)后腦中抑制性氨基酸GABA的含量會(huì)升高，其原因在于一方面隨著去甲腎上腺素釋放的減少、ATP含量的下降，對(duì)谷氨酸脫羧酶的抑制作用減少，而造成GABA生產(chǎn)的增多;同時(shí)，疲勞時(shí)琥珀酸半醛脫氫酶活性下降，GABA氧化強(qiáng)度減弱，在腦中堆積[5]。3）多巴胺能作用是調(diào)節(jié)肌緊張，使機(jī)體做好進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的準(zhǔn)備。而超常運(yùn)動(dòng)期間多巴胺活性減弱使其控制運(yùn)動(dòng)的能力下降，并通過運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的降低導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞的出現(xiàn)[6]。4）Ach是人體內(nèi)普遍存在的神經(jīng)遞質(zhì)，與記憶、意識(shí)和溫度調(diào)節(jié)等有關(guān)。Ach的合成是由乙酰輔酶A（CoA）和膽堿在膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶-膽堿乙?；缸饔孟庐a(chǎn)生。而長時(shí)間運(yùn)動(dòng)會(huì)耗竭膽堿，導(dǎo)致Ach難以合成，進(jìn)而產(chǎn)生疲勞[7]。

3.2 中醫(yī)對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞的認(rèn)識(shí)

中醫(yī)典籍中并無 “運(yùn)動(dòng)性疲勞”的論述，但與形體過用產(chǎn)生的疲勞及其相關(guān)病因病機(jī)的記載頗多。在中醫(yī)看來，運(yùn)動(dòng)性疲勞本屬過于勞動(dòng)形體而產(chǎn)生的全身倦怠和精神困倦的生理病理過程[8]。如 《素問》中提出 “持重遠(yuǎn)行，汗出于腎;疾走恐懼，汗出于肝;搖體勞苦，汗出于脾。故春夏秋冬，四時(shí)陰陽，生病起于過用，此為常也?！睗h代張仲景在 《金匱要略》中提出，疲勞與 “虛勞病”同類，認(rèn)為疲勞的病機(jī)為氣虛所致，有 “勞則氣耗，勞則喘息汗出，內(nèi)外皆越，故氣耗矣”的論述。而 《千金方》中將 “勞”分為五勞，即肺勞、肝勞、心勞、脾勞、腎勞?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)性疲勞是由于強(qiáng)力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致臟腑正常機(jī)能下降，出現(xiàn)喘息、大汗出、疲乏等表現(xiàn)，其機(jī)理是過勞常勞其形體，傷其臟腑、神志，耗損大量陽氣、精血、津液，造成陰陽失和的狀態(tài)[9]?，F(xiàn)代中醫(yī)研究雖然對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞的改善提出了補(bǔ)肝腎、補(bǔ)脾腎、健脾胃、扶正理氣等等諸多不同的方法，但大多數(shù)研究者都認(rèn)同“虛則補(bǔ)之”的治法，即以進(jìn)補(bǔ)的方式改善臟腑功能、促進(jìn)疲勞的恢復(fù)。

3.3 人參皂甙Rg1和Rb1抗疲勞的療效與機(jī)制

《神農(nóng)本草經(jīng)》把人參列為上品，有 “主補(bǔ)五臟、安精神、止驚悸、除邪氣、明目、開心益智”的記述。現(xiàn)在研究表明人參皂甙是人參生理活性最重要的有效成分，從植物人參和西洋參中已分離出20余種皂甙。根據(jù)中醫(yī)理論 “虛則補(bǔ)之”，可以選擇人參及其主要提取物人參皂甙進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性疲勞的防治研究和運(yùn)用。以往研究表明[10～14]，人參皂甙Rg1和Rb1是人參促智的主要有效成分。人參皂甙Rg1具有抗氧化、抗衰老，減輕神經(jīng)功能損傷的作用，人參皂甙Rg1和Rb1均具神經(jīng)營養(yǎng)和選擇性神經(jīng)保護(hù)作用，可促進(jìn)神經(jīng)元突觸再生、增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元抗損傷、保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡率的作用、降低大鼠中風(fēng)病急性期缺氧、缺糖再給氧損傷神經(jīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞等死亡率。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)中等強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)復(fù)制的運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺和乙酰膽堿含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)人參皂甙 Rg1和Rb1均能有效的降低下丘腦5-HT和GABA的含量，提高DA和Ach的含量;和人參皂甙Rg1比較，人參皂甙 Rb1在降低5-HT和GAGB含量、提高DA含量方面效果更優(yōu)，但在提高Ach含量方面效果相對(duì)較差?？偟恼f來，人參皂甙Rg1和Rb1均能改善運(yùn)動(dòng)性疲勞狀態(tài)下中樞神經(jīng)遞質(zhì)紊亂的情況，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用，達(dá)到抗中樞疲勞的效應(yīng)，但人參皂甙Rb1的效果相對(duì)更優(yōu)。

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