HSP60及 TLR4信號(hào)途徑在小鼠心臟移植物中的表達(dá)及意義＊

陳家軍, 吳宏妍, 孫宗全, 聶榮華, 吳富常, 張?jiān)鐾?/p>

(1襄樊市中心醫(yī)院心胸外科,湖北襄樊 441021;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心外科,湖北武漢 430022)

移植排斥反應(yīng)是制約心臟移植遠(yuǎn)期效果的重要因素,其機(jī)制目前尚未完全闡明。近來(lái)很多證據(jù)顯示 Toll樣受體 4(Toll-like receptor,TLR4)信號(hào)途徑在啟動(dòng)移植排斥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的橋梁作用[1],熱休克蛋白 60(heat shock protein,HSP60)作為內(nèi)外源性配體與 TLR4等分子結(jié)合,可能通過(guò)調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的活化、分化群 80(cluster of differentiation 80,CD80)等第二信號(hào)的表達(dá),在移植免疫中發(fā)揮重要作用[2,3]。為了解 HSP60及 TLR4信號(hào)途徑心臟移植排斥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制,我們對(duì)小鼠心臟移植物HSP60、TLR4及其下游分子髓樣分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子 -κB (NF-κB)的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。

材 料 和 方 法

1 材料

抗小鼠HSP60、MyD88及NF-κB抗體購(gòu)于Lab vision,抗小鼠 TLR4抗體購(gòu)于 Abcam,辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔 IgG抗體及羊抗小鼠 IgG抗體購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司,ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒為 Pierce產(chǎn)品,細(xì)胞因子 EL ISA試劑盒購(gòu)于晶美公司,其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 動(dòng)物分組與模型

健康雄性BALB/c小鼠 12只和 C57BL/6小鼠36只,體重 20-25 g,2-3個(gè)月齡,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所提供。隨機(jī)分為 2組: (1)對(duì)照組(同系移植組):供、受體各 12只,供、受體均為 C57BL/6小鼠;(2)實(shí)驗(yàn)組 (同種異品系移植組):供、受體各 12只,供、受體分別為 BALB/c、C57BL/6小鼠。采用袖套管技術(shù)制作小鼠頸部心臟移植模型,自制內(nèi)徑分別為0.4 mm和0.6 mm的動(dòng)、靜脈套管,利用套管將受者頸總動(dòng)脈與供心主動(dòng)脈吻合,受者頸外靜脈與供心肺動(dòng)脈吻合,術(shù)后每天觸診觀察移植心存活時(shí)間。

3 免疫組化檢測(cè)心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及NF-κB表達(dá)的變化

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心臟移植物,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片。然后脫蠟、水化,3% H2O2室溫封閉 5-10 min,羊血清封閉液室溫封閉 30 min。滴加各種Ⅰ抗,4℃濕盒過(guò)夜,PBS清洗后滴加1∶100辣根酶HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgGⅡ抗,室溫孵育30 min,PBS清洗后滴加辣根過(guò)氧化物酶,DAB顯微鏡下控制顯色,蘇木素復(fù)染。顯微鏡觀察、攝像。

4 W estern blott ing檢測(cè)心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB的表達(dá)

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心臟移植物,參照《分子克隆》的實(shí)驗(yàn)方法,包括蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)印、雜交及顯色,X光片曝光顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

5 病理分析及排斥反應(yīng)分級(jí)

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心臟移植物,做病理切片,蘇木精 -伊紅(HE)染色,光鏡觀察,并對(duì)病理組織排斥反應(yīng)等級(jí)評(píng)分,分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]:0級(jí):無(wú)排斥反應(yīng)表現(xiàn);1級(jí):少量而散在的單核細(xì)胞浸潤(rùn)或輕度的心肌細(xì)胞變性;2級(jí):中度的單核細(xì)胞浸潤(rùn)或片狀心肌細(xì)胞變性;3級(jí):中、重度單核細(xì)胞浸潤(rùn)與明顯的心肌細(xì)胞變性和/或灶狀壞死;4級(jí):重度單核細(xì)胞浸潤(rùn)與大片心肌細(xì)胞變性、壞死,間質(zhì)可有出血。

6 酶聯(lián)免疫法(EL ISA)檢測(cè)受體小鼠血 TNF-α、I L-12及 IFN-γ的濃度

分別于移植后第 3 d、第 7 d取小鼠血清,按EL ISA試劑盒說(shuō)明操作,每組設(shè) 3復(fù)孔,檢測(cè) TNF-α、IFN-γ和 IL-12的含量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13.0軟件包分析,數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 免疫組化檢測(cè)心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及NF-κB的變化

對(duì)照組移植術(shù)后 3 d、7 d移植心臟局部 HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB均呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá),而實(shí)驗(yàn)組均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),HSP60、MyD88及NF-κB 7 d時(shí)的表達(dá)均強(qiáng)于 3 d時(shí),而 TLR4 3 d時(shí)的表達(dá)強(qiáng)于 7 d時(shí)。HSP60的表達(dá)主要位于心肌細(xì)胞胞漿及浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞;TLR4的表達(dá)主要分布于心肌細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍、心肌間浸潤(rùn)的單核細(xì)胞;MyD88主要表達(dá)于心肌細(xì)胞胞漿;NF-κB主要表達(dá)于心肌細(xì)胞及血管周圍、心肌間浸潤(rùn)的單核細(xì)胞,見圖 1-4。

2 W estern blotting檢測(cè)心臟移植物 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB的表達(dá)

對(duì)照組移植術(shù)后 3 d、7 d移植心臟局部 HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB的表達(dá)均較低;實(shí)驗(yàn)組移植術(shù)后7 d時(shí)HSP60、MyD88及NF-κB的表達(dá)明顯高于移植術(shù)后 3 d,TLR4 3 d時(shí)的表達(dá)強(qiáng)于 7 d時(shí)。與對(duì)照組相比,各時(shí)點(diǎn) HSP60、MyD88及NF-κB的表達(dá)均增強(qiáng),差異顯著 (P＜0.05),見圖 5。

3 心臟移植物病理形態(tài)分析

對(duì)照組移植術(shù)后 3 d、7 d均未見明顯移植排斥反應(yīng);實(shí)驗(yàn)組移植術(shù)后 3 d排斥反應(yīng)的病理分級(jí)為 2 -3級(jí),7 d時(shí)為 4級(jí),見圖 6。

Figure 1. Expression of HSP60 in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control(isograft)group;B:experimental(allograft)group.圖 1 免疫組化顯示 HSP60在 2組心臟移植物中的表達(dá)變化

Figure 2. Expression of TLR4 inimmunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:experimental group.圖 2 免疫組化顯示 TLR4在 2組心臟移植物中的表達(dá)變化

Figure 3. Expression of MyD88 in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:exper imental group.圖 3 免疫組化顯示M yD88在 2組心臟移植物中的表達(dá)變化

Figure 4. Expression of NF-κB in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:experimental group.圖4 免疫組化顯示 NF-κB在2組心臟移植物中的表達(dá)變化

4 心臟移植后外周血 TNF-α、I L-12及 IFN-γ的變化

對(duì)照組移植術(shù)后 3 d、7 d外周血 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ的濃度未見明顯變化;與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)外周血 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ的濃度明顯升高,且 7 d較 3 d時(shí)的濃度顯著升高,差異顯著(P＜0.01),見圖 7。

Figure 5.Expression of HSP60,TLR4,MyD88 and NF-κB in cardiac transplantation from two groups by Western blotting.±s.n=6.★P＜0.05vscontrol group,▲P＜0.05vsexperimental group at 3d after heart transplantation.圖 5 W estern blott ing檢測(cè) HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB蛋白在 2組心臟移植物不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)變化

討 論

最近研究認(rèn)為,Toll樣受體 (TLRs)及其信號(hào)途徑是銜接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁,在移植免疫中扮演重要角色[5]。TLR4所識(shí)別的病原相關(guān)分子模式配體包括外源性微生物分子,以及細(xì)胞膜破損和應(yīng)激釋放的內(nèi)源性物質(zhì)。心臟移植手術(shù)創(chuàng)傷、缺血再灌注及應(yīng)激損傷均可使細(xì)胞釋放抗原性很強(qiáng)的 HSP60,并通過(guò) TLR4以MyD88依賴的途徑活化單核巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞[6],激活NF-κB,活化相關(guān)免疫基因,上調(diào)前炎性細(xì)胞因子、CD80、CD86等共刺激分子和化學(xué)趨化因子表達(dá),促使DC等抗原提呈細(xì)胞成熟,誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子,引起急慢性排斥反應(yīng)[7]。

本研究顯示,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn) HSP60的表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組,同時(shí)伴有 TLR4、MyD88及NF-κB的表達(dá)增高,且實(shí)驗(yàn)組心臟移植物出現(xiàn)明顯排斥反應(yīng),說(shuō)明 HSP60作為內(nèi)源性抗原物質(zhì)參與了移植排斥反應(yīng)。正常條件下,HSP60以穩(wěn)定狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中,應(yīng)激時(shí) HSP60迅速?gòu)陌|(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白[8],保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激傷害作用,提高細(xì)胞的“應(yīng)急耐受”能力,而當(dāng)心臟移植后 HSP60釋放至細(xì)胞外時(shí),則作為同種異體抗原激活炎性反應(yīng)[9]。關(guān)于 HSP60參與排斥反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Figure 6.Cardiac transplantswere stainedwith HE formorphological evaluation in two groups at7 d after transplantation(HE staining, ×200).A:control group;B:experimental group.圖 6 HE染色及 2組心臟移植物 7 d時(shí)病理組織學(xué)變化

Figure 7.Expression of TNF-α,IFN-γand IL-12 in peripheral blood from two groups by EL ISA.A:expression of TNF-αin two groups;B:expression of IFN-γ in two groups;C:expression of IL-12 in two groups. ±s.n=6.＊＊P＜0.01vscontrol group;▲▲P＜0.01vsexperimental group(3 d).圖 7 心臟移植后 2組外周血中 TNF-α、IFN-γ及 I L-12濃度比較

本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn) TLR4、MyD88及NF-κB的表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組,且 7d時(shí)MyD88及NF-κB的表達(dá)明顯高于移植術(shù)后 3d,說(shuō)明在心臟移植排斥反應(yīng)中存在 TLR4信號(hào)途徑的激活。有證據(jù)顯示細(xì)胞因子參與了移植排斥反應(yīng)[10],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)外周血中 TNF-α、 IL-12及 IFN -γ的濃度明顯升高,實(shí)驗(yàn)組 7d時(shí)細(xì)胞因子的濃度明顯高于 3d,且與排斥反應(yīng)的病理分級(jí)變化一致,表明上述細(xì)胞因子與心臟移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TNF-α、 IL-12及 IFN-γ均為 Th1型細(xì)胞因子,其中 IL-12最為重要,主要由抗原提呈細(xì)胞,如單核巨噬細(xì)胞及DC產(chǎn)生,少部分由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[11]。 IL-12作為一種多功能細(xì)胞因子,在移植排斥反應(yīng)中具有獨(dú)特的生物學(xué)作用[12,13]:促進(jìn) T細(xì)胞及自然殺傷(NK)細(xì)胞增殖;誘導(dǎo)細(xì)胞毒性 T細(xì)胞成熟并增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用;誘導(dǎo)靜止及活化NK細(xì)胞及 T細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ;誘導(dǎo)其它細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α、IL-2、 IL-3等 Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生,促進(jìn) Th1細(xì)胞發(fā)育,同時(shí)抑制 Th2細(xì)胞發(fā)育。

單核/巨噬細(xì)胞的激活、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)是移植排斥發(fā)生的重要機(jī)制,細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞因子間的作用是其發(fā)生的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中,免疫組化提示 HSP60、TLR4、MyD88及 NF-κB多分布于心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍、心肌間浸潤(rùn)的單核細(xì)胞 (圖 1-4),由此我們可以推測(cè),心臟移植后釋放 HSP60及其它多種內(nèi)源性物質(zhì),經(jīng)抗原提呈細(xì)胞提呈給 T細(xì)胞,以MyD88依賴的方式激活 T細(xì)胞增殖,同時(shí)心肌細(xì)胞間及血管內(nèi)的粒單核細(xì)胞等細(xì)胞表面的 TLR4被激活,促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及DC釋放 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ等炎性介質(zhì),導(dǎo)致早期炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)椒磻?yīng),促進(jìn)排斥反應(yīng),但其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。Western blotting顯示實(shí)驗(yàn)組 7 d時(shí) TLR4的表達(dá)弱于 3 d時(shí),與MyD88及NF-κB的變化不一致,可能的原因?yàn)?心臟移植后在大量?jī)?nèi)外源性抗原刺激下,機(jī)體啟動(dòng)了負(fù)反饋調(diào)節(jié)的保護(hù)機(jī)制,通過(guò)內(nèi)吞作用,將 TLR4配體受體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到溶酶體中降解,即受體下行調(diào)節(jié),清除有害的炎癥因子,減輕其對(duì)機(jī)體的損害[14]。

本研究結(jié)果表明,心臟移植后釋放的內(nèi)源性配體 HSP60可能激活 TLR4信號(hào)途徑引起排斥反應(yīng),提示 HSP60在移植排斥反應(yīng)中可能具有重要作用,調(diào)控其受體后信號(hào)途徑可能為抗排斥反應(yīng)提供新思路。

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