粘細(xì)菌A HB103-1發(fā)酵生產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)

徐 鳳, 陶文沂＊,2

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫214122)

粘細(xì)菌是一類具有復(fù)雜多細(xì)胞形態(tài)的革蘭氏陰性菌,它能產(chǎn)生豐富的活性次級(jí)代謝物,這些物質(zhì)不但結(jié)構(gòu)新穎,而且具有其他微生物的代謝物所不具備的活性作用機(jī)制[1],尤其是其中的纖維堆囊菌屬活性物質(zhì)的產(chǎn)率更高,達(dá)96%。1987年,在纖維堆囊菌中發(fā)現(xiàn)與紫杉醇具有相同作用機(jī)制的epothilones之后,它更激起人們廣泛的研究興趣[2]。AHB103-1也是一種纖維堆囊菌,作者重點(diǎn)研究了它發(fā)酵生產(chǎn)抗癌活性物質(zhì)的工藝條件和培養(yǎng)基組成,并對(duì)它的形態(tài)和理化特征也進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 纖維堆囊菌AHB103-1,作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)種子培養(yǎng)基[3-4](組分 g/L):土豆淀粉10.0,葡萄糖2.0,酵母粉2.0,脫脂奶粉4.0。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基:氮源優(yōu)化培養(yǎng)基(組分g/L):玉米淀粉12.0,各種氮源6.0,甘油5.0,XAD-16大孔樹脂20.0。

3)碳源優(yōu)化培養(yǎng)基(組分 g/L):各種碳源12.0,酵母粉 6.0,甘油 5.0,XAD-16大孔樹脂20.0。

4)碳氮比優(yōu)化培養(yǎng)基(組分 g/L):玉米淀粉12.0,酵母粉 7 個(gè)水平(2、4、6、8、10、12、15),甘油5.0,XAD-16大孔樹脂20.0。

5)α-CEV Y/4 平皿培養(yǎng)基(組分 g/L):α-纖維素 1.0,安琪活性干酵母 2.5,CaCl21.0,瓊脂15.0。

6)各種碳源平皿培養(yǎng)基(組分g/L):碳源(蔗糖、麥芽糖、木糖、纖維二糖、半乳糖、馬鈴薯淀粉、山梨糖、果糖、α-纖維素、甘露糖)10.0,KNO35.0,瓊脂15.0。

7)葡萄糖平皿培養(yǎng)基(組分g/L):葡萄糖分別為 10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0,KNO35.0,瓊脂15.0。

8)硫銨平皿培養(yǎng)基(組分 g/L):馬鈴薯淀粉10.0,硫銨 5.0,瓊脂 15.0。

除α-CEV Y/4平皿培養(yǎng)基外,以上所有培養(yǎng)基均額外添加以下無機(jī)物質(zhì)(組分g/L):CaCl21.0,MgSO4·7H2O 1.0,Fe(Ⅲ)-Na-EDTA 0.008。

以上各種培養(yǎng)基均用10%KOH調(diào)p H至7.2,121℃滅菌20 min。

1.1.3 活性物質(zhì)篩選培養(yǎng)基 10%小牛血清,90%RPMI1640,2 mmol/L L-谷氨酰胺,100 U青霉素和100 U的鏈霉素。

1.1.4 腫瘤細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞 Hep G 2,江南大學(xué)生物制藥系分子藥理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 待測(cè)活性樣品的制備 取樹脂的甲醇提取液200μL置于恒重的離心管中,于45℃真空干燥至恒重,用20μL DMSO溶解樣品。

1.2.2 細(xì)胞毒活性測(cè)定 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Hep G2癌細(xì)胞,配制成單細(xì)胞懸液,每孔8 000個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃培養(yǎng)24 h后加樣,每種樣品取5μL,用培養(yǎng)液稀釋到1 mL后加入96孔板,每孔加200μL含樣品的培養(yǎng)液,設(shè)4個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,各孔再加入20μL 5 mg/mL MTT液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,每孔加200μL DMSO,振蕩10～20 min,570 nm波長(zhǎng)測(cè)定A值,重復(fù)3次,計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率[5-6]。

1.2.3 細(xì)胞毒作用的顯微拍照 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2癌細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度1×105個(gè)/mL,加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。饑餓培養(yǎng)24 h后,換正常培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h,然后分別加入樣品,37℃培養(yǎng)24、48 h后顯微拍照[7-8]。

1.2.4 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,利用L18(36)正交表對(duì)發(fā)酵時(shí)間、起始p H值、發(fā)酵溫度、接種種齡、搖瓶裝液量、搖床轉(zhuǎn)速等影響比較顯著的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 粘細(xì)菌的形態(tài)及生理生化特征

粘細(xì)菌AHB103-1為末端鈍圓的桿狀菌,外有一層黏液狀莢膜包裹,無鞭毛,見圖1。透射電鏡下營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞大小為0.8～1.0μm×2.5～3.0μm。在α-CEV Y/4平皿培養(yǎng)基上菌落為灰白色,呈放射狀生長(zhǎng),菌落直徑達(dá)5～7 mm,有少量黏液產(chǎn)生。這種菌在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形態(tài)差異很大,在各種糖類較豐富的培養(yǎng)基上均發(fā)育為乳白晶瑩的菌落,上有一層透明的黏液,發(fā)育至5～6 d時(shí),甘露糖、馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基上黏液明顯變黃,菌開始聚集,標(biāo)志著開始形成子實(shí)體。其他幾種糖類培養(yǎng)基上未觀察到聚集現(xiàn)象。而在碳源匱乏的培養(yǎng)基(葡萄糖≤0.2 g/dL)或者難利用的培養(yǎng)基(α-纖維素)上,菌落皆米白,不透明,沒有黏液產(chǎn)生,菌不聚集。由此可知,雖然AHB103-1的子實(shí)體是在營(yíng)養(yǎng)快耗竭時(shí)產(chǎn)生,但那些本來就營(yíng)養(yǎng)匱乏的培養(yǎng)基也不容易形成子實(shí)體。那些透明的黏液可能是菌聚集的必要條件,粘細(xì)菌可能是通過這些黏液來運(yùn)動(dòng)的,而黏液的形成與基質(zhì)中糖的質(zhì)量濃度密切相關(guān)。粘細(xì)菌AHB103-1的生理生化特征見表2。

圖1 粘細(xì)菌AHB103-1的不同形態(tài)特征Fig.1 Different morphological features of myxobacteria AHB103-1

表2 粘細(xì)菌AHB103-1的生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical features of myxobacteria AHB103-1

2.2 粘細(xì)菌AHB103-1發(fā)酵條件的研究

2.2.1 碳氮源的優(yōu)化 圖2比較了不同氮源對(duì)總活性的影響。以酵母粉為惟一氮源時(shí),總抑制率最高,2 mL發(fā)酵液所含的活性物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)84.52%,花生餅粉次之,總抑制率為76.85%。無機(jī)氮源氯化銨、硫酸銨、KNO3為惟一氮源時(shí)總抑制率明顯低于各種有機(jī)氮源,其中硫酸銨的總抑制率僅為 6.07%。以 KNO3為惟一氮源時(shí),菌AHB103-1可以良好生長(zhǎng),但其總活性卻比各種有機(jī)氮源低得多?？赡苁且?yàn)楦鞣N有機(jī)氮源含有活性物質(zhì)的前體或促進(jìn)因子。

圖3比較了不同碳源對(duì)總活性的影響。以玉米淀粉為惟一碳源時(shí),總抑制率最高,2 mL發(fā)酵液所含的活性物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)74.68%。α-纖維素次之,總抑制率為73.72%。而葡萄糖為惟一碳源時(shí),活性物含量最低,僅為38.13%。由此可知,緩慢利用的碳源更適合用來生產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)。

圖2 氮源對(duì)總抑制率的影響Fig.2 Influence of carbon sources on the total inhibition rate

圖3 碳源對(duì)總抑制率的影響Fig.3 Influence of carbon sources on the total inhibition rate

圖4比較了不同碳氮比對(duì)總活性的影響。當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度由2 g/L升高至6 g/L時(shí),總抑制率也相應(yīng)由47.55%迅速增加至85.07%,但氮源質(zhì)量濃度由6 g/L繼續(xù)增至15 g/L時(shí),總抑制率變化很小。

圖4 碳氮比對(duì)總抑制率的影響Fig.4 Influence of C/N on the total inhibition rate

因此,氮源選擇酵母粉,碳源選擇玉米淀粉,碳氮比選擇12∶6時(shí)較有利于抗腫瘤活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.2.2 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化見表3。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.3 Rusults and range analysis of orthogonal experiment for fermentation conditions

根據(jù)極差R的大小排出各因素作用的主次次序?yàn)锳>D>C>E>B>F,即發(fā)酵時(shí)間>接種種齡>發(fā)酵溫度>500 mL搖瓶裝液量>起始p H值>搖床轉(zhuǎn)速,發(fā)酵時(shí)間和接種種齡對(duì)總活性的影響最為顯著。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件為A1B3C2D2E3F2,即發(fā)酵時(shí)間 7 d,起始 p H 7.4,發(fā)酵溫度30℃,接種種齡4 d,500 mL搖瓶裝液量125 mL,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

2.2.3 前體物質(zhì)和微量元素的影響 氨基酸作為菌體蛋白質(zhì)合成的底物,影響著菌的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。圖5研究了不同質(zhì)量濃度的氨基酸對(duì)總活性的影響。當(dāng)添加量為5 mg/L時(shí),Ala(丙氨酸)、Glu(谷氨酸)、Gly(甘氨酸)相對(duì)空白組均對(duì)總活性有大幅度的提高,其中Ala對(duì)總抑制率提高幅度最大,達(dá)34.63%。而添加5 mg/L的 Trp(色氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Tyr(酪氨酸)時(shí) ,總活性反而下降,添加 Trp總活性下降最明顯,達(dá)89.80%,可能低質(zhì)量濃度的 Trp、Phe、Tyr對(duì)活性物的產(chǎn)生有抑制作用。當(dāng)添加量升至10 mg/L時(shí),Gly、Glu、Ala、Thr組的總活性均有下降,其中 Gly組下降的幅度最大,當(dāng)質(zhì)量濃度由5 mg/L提高到10 mg/L時(shí),總抑制率下降了59.05%,比空白組低48.37%;而Ala組相對(duì)空白組對(duì)總活性仍有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)質(zhì)量濃度由5 mg/L提高到10 mg/L時(shí),Trp組的總抑制率提高了10.84倍,相對(duì)空白總活性提高了27.65%;Tyr組的總抑制率提高了1.68倍,相對(duì)空白總活性提高了38.17%。因此 ,培養(yǎng)基中添加 5 mg/L Gly、Glu、Ala,10 mg/L Trp、Tyr對(duì)活性物的產(chǎn)生會(huì)有明顯的促進(jìn)作用。

圖5 氨基酸對(duì)總抑制率的影響Fig.5 Influence of amino acid on the total inhibition rate

無機(jī)鹽和微量元素可能影響菌體酶系的作用從而影響菌體內(nèi)的許多生物合成途徑,因而可能對(duì)活性物質(zhì)的產(chǎn)生有一定的影響,結(jié)果見圖6。Li-SO4、MnCl2、Na2MoO4、NaH2PO4對(duì)總活性均有明顯的提高,其中 NaH2PO4提高的幅度最大,達(dá)38.34%。而 K2HPO4、CuSO4、ZnSO4均對(duì)總活性有強(qiáng)烈的抑制,總活性分別下降了 97.66%、96.48%、96.84%。因此,在培養(yǎng)基中添加 1.0 mg/L的 LiSO4、MnCl2、Na2MoO4和 NaH2PO4有利于總活性的提高。

圖6 氨基酸對(duì)總抑制率的影響Fig.6 Influence of inorganic salts on the total inhibition rate

2.3 活性物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

進(jìn)一步研究了 AHB103-1的代謝產(chǎn)物對(duì)Hep G2形態(tài)的影響,結(jié)果見圖7。加藥24 h后,加藥組相對(duì)空白組的細(xì)胞數(shù)目明顯減少,活性物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用,有少量細(xì)胞開始凋亡,懸浮在培養(yǎng)液中,但相對(duì)未加藥時(shí)活細(xì)胞總數(shù)基本沒變。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時(shí),培養(yǎng)液中大量細(xì)胞開始凋亡,活細(xì)胞很少,少量存活的細(xì)胞形態(tài)也有明顯的改變,細(xì)胞變得腫脹,明顯拉長(zhǎng)。而對(duì)照組細(xì)胞飽滿,貼壁生長(zhǎng)良好,細(xì)胞數(shù)量相對(duì)0、24 h明顯增加。

圖7 加樣前后腫瘤細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.7 The morphological change of tumor cell before and after adding sample

3 結(jié) 語

粘細(xì)菌AHB103-1可以利用蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖,不能利用D-果糖、L-山梨糖、D-木糖。能在以硫銨和 KNO3為惟一氮源的瓊脂平皿上發(fā)育為菌落。在不同的固體培養(yǎng)基上形態(tài)差別較大,在各種糖類較豐富的培養(yǎng)基上均發(fā)育為乳白晶瑩的菌落,上有一層透明的黏液,而在碳源匱乏(葡萄糖≤0.2%)或者難利用(α-纖維素)時(shí),菌落皆米白,不透明,沒有黏液產(chǎn)生,菌不聚集。

以對(duì)人肝癌細(xì)胞 Hep G2的總抑制率為選擇指標(biāo)時(shí),碳源選擇玉米淀粉,氮源選擇酵母粉,碳氮比選擇12:6,培養(yǎng)基中添加5 mg/L Gly、Glu和Ala,10 mg/L Trp和 Tyr,1.0 mg/L的LiSO4、MnCl2、Na2MoO4和NaH2PO4對(duì)活性物質(zhì)的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時(shí)間7 d,起始p H 7.4,發(fā)酵溫度30 ℃,接種種齡4 d,500 mL搖瓶裝液量125 mL,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

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