用均勻設(shè)計優(yōu)選苦參半仿生提取法工藝條件*

王英姿，惠建國，張兆旺，孫秀梅

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250014）

用均勻設(shè)計優(yōu)選苦參半仿生提取法工藝條件*

王英姿1，惠建國2，張兆旺2，孫秀梅2

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250014）

[目的]優(yōu)選苦參的半仿生提取法工藝條件。[方法]采用UL（91×33）均勻?qū)嶒炘O(shè)計，以苦參堿、氧化苦參堿、苦參總堿、高效液相色譜（HPLC）總面積、干浸膏為指標(biāo)綜合評判，優(yōu)選苦參半仿生提取的工藝條件。[結(jié)果]3煎用水的pH值依次為2.200 8、7.468 5、8.989 0；3煎總計時間為3.918 0 h。[結(jié)論]結(jié)合生產(chǎn)實際，確定3煎用水的pH值依次為2.0、7.5、9.0；提取時間依次為 2.0、1.0、1.0 h。

苦參；半仿生提取法；均勻設(shè)計；多成分指標(biāo)；綜合評判

苦參為清熱燥濕，殺蟲，利尿藥。主含苦參堿、氧化苦參堿等生物堿以及黃酮等成分?？鄥A、氧化苦參堿及苦參總堿具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗腫瘤等多方面藥理作用。為體現(xiàn)其整體功能，根據(jù)半仿生提取法（SBE法）的理論[1-3]，以苦參堿、氧化苦參堿、苦參總堿、高效液相色譜（HPLC）總面積、浸膏得率為綜合評判指標(biāo)，采用均勻設(shè)計優(yōu)選其SBE法的工藝條件。

1 儀器與材料

pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；MA110型電子分析天平（上海第二分析儀器廠）；LXJ－Ⅲ型離心沉淀機(jī)（上海醫(yī)療器械三廠）；Agilent 1100高效液相色譜儀。

苦參經(jīng)張兆旺教授鑒定，為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根經(jīng)加工制成的飲片。苦參堿對照品（批號：0805-200005，供含量測定用）、氧化苦參堿對照品（批號：0780-200004，供含量測定用）均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 實驗設(shè)計 根據(jù)SBE法理論，在藥材粒度、煎煮溫度、煎煮用水量、濾過等條件相同的前提下，確定考察的主要因素及水平，選用均勻設(shè)計法（UL）（91×33）表(中國航天工業(yè)總公司第三研究院提供)安排實驗方案，見表1。

2.2 樣品液的制備 稱取苦參粗粉（10～20目之間）20.0 g，常壓加熱回流提取3次（加水量分別為苦參重量的10，8，8倍，溶劑水的pH值及提取時間按表2），提取液用4層紗布加100目篩分別濾過，離心（3 000r/min，15min），合并上清液，定容至 500 mL，即得1～9號樣品液（每毫升相當(dāng)于苦參0.04 g）。

表 1 UL（91×33）實驗設(shè)計表Tab.1 Chart of UL（91×33）design

2.3 對照液的制備 精密稱取苦參堿對照品15.60 mg，用乙腈-無水乙醇(80∶20)溶解并定容至25 mL，制成對照液A（每毫升含苦參堿0.624 mg）。

精密稱取氧化苦參堿對照品17.68 mg，加乙腈－無水乙醇（80∶20）溶解并定容至 10 mL，制成對照液B（每毫升含苦參堿 1.768 mg）。

2.4 供試液的制備 精密量取2.2項下樣品液10mL，加氨水調(diào) pH 9～10，用氯仿萃?。?0 mL，6次），合并萃取液，回收溶劑至干，殘渣加無水乙醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得1～9號供試液（每毫升相當(dāng)于苦參0.016g）。

2.5 苦參堿及氧化苦參堿的含量測定

2.5.1 色譜條件[4]色譜柱：Lanbo NH2柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－無水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）；流速：1 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.5.2 線性關(guān)系考察

2.5.2.1 苦參堿線性關(guān)系考察 精密吸取2.3項下對照液 A，用乙腈-無水乙醇（80∶20）稀釋成 0.015 6、0.031 2、0.046 8、0.062 4、0.07 8、0.093 6 g/L 的對照液A1～6，按2.5.1項下色譜條件，依法測定。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=11740X-32.585，r＝0.999 6，表明在0.0156～0.0936g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2.2 氧化苦參堿線性關(guān)系考察 精密吸取2.3項下對照液B，用乙腈-無水乙醇（80∶20）稀釋成0.044 2、0.132 6、0.221、0.309 4、0.397 8、0.486 2 g/L的對照液B1～6。按2.5.1項下色譜條件，依法測定。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得一條不過原點的直線，回歸方程為：Y=10 524X+58.726，r＝0.999 2，表明在0.044 2～0.486 2 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度實驗

2.5.3.1 苦參堿精密度實驗 取2.5.2.1項下苦參堿對照液 A3（0.046 8 g/L），按 2.5.1 項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明精密度良好，RSD=0.48%。

2.5.3.2 氧化苦參堿精密度實驗 取2.5.2.2項下氧化苦參堿對照液 B3（0.221 g/L），按 2.5.1項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明精密度良好，RSD=0.72%。

2.5.4 穩(wěn)定性實驗 取2.4項下1號供試液，于0、2、4、6、8 h按2.5.1項下色譜條件，測定苦參堿和氧化苦參堿峰面積，結(jié)果表明穩(wěn)定性較好，RSD分別為0.41%、0.55%。

2.5.5 重復(fù)性實驗 取2.2項下1號樣品液，按2.4項下供試液的制備方法平行提取5次，按2.5.1項下色譜條件，測定苦參堿和氧化苦參堿峰面積，結(jié)果表明重現(xiàn)性較好，RSD分別為0.71%、0.93%。

2.5.6 樣品測定 吸取2.4項下供試液，按2.5.1項下色譜條件，依法測定，結(jié)果見表2。

2.5.7 加樣回收實驗

2.5.7.1 苦參堿加樣回收實驗 取2.2項下1號樣品液4.5 mL（含苦參堿0.576 7 mg），加入2.3項下對照液A 1.0 mL，按2.4項下方法制備成供試液，測定苦參堿含量，計算回收率，結(jié)果回收率為97.52%，RSD 為 1.32%（n=5）。

2.5.7.2 氧化苦參堿加樣回收實驗 取2.2項下1號樣品液5 mL（含氧化苦參堿3.036 4 mg），加入2.3項下對照液B 1.70 mL，按2.4項下方法制備成供試液，測定苦參堿含量，計算回收率，結(jié)果回收率為98.21%，RSD為1.51%（n=5）。

2.6 苦參總堿的含量測定 取2.4項下供試液15mL（相當(dāng)于苦參0.24 g），置于三角瓶中，水浴蒸干，殘渣加乙醚5 mL使溶解。精密加0.01 mol/L硫酸液10 mL，搖勻，水浴加熱使殘渣完全溶解，并除盡乙醚后放冷。加新沸過的冷蒸餾水15 mL與甲基紅指示液2滴，用0.020 84 mol/L氫氧化鈉試液滴定至黃色，即得。以乙醇15 mL和0.01 mol/L硫酸液10 mL作空白對照。按下式計算苦參總堿的含量（mg/g），結(jié)果見表2?？鄥⒖倝A含量（mg/g）=

式中：c―氫氧化鈉滴定液摩爾濃度；v1―空白液消耗氫氧化鈉滴定液毫升數(shù)；v―供試液消耗氫氧化鈉滴定液毫升數(shù)；248―苦參堿（C15H24N2O）分子量。

2.7 HPLC總面積測定 取2.4項下供試液，按2.5.1項下色譜條件測定，記錄總積分面積，結(jié)果見表2。

表2 綜合各指標(biāo)成分含量及標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果Tab.2 Results of the content of each ingredient and itscontent after the standard processing

2.8 干浸膏的測定 精密吸取2.2項下樣品液各20 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘至恒質(zhì)量，計算干浸膏含量。結(jié)果見表2（n=3）。

2.9 實驗結(jié)果的處理 將苦參堿、氧化苦參堿、苦參總堿、HPLC總面積、干浸膏5個指標(biāo)測定的數(shù)據(jù)按公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。為標(biāo)準(zhǔn)化后的值，為樣品液i中成分j的含量，為樣品中i種成分j的平均值，為成分j的標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)各指標(biāo)在提取工藝選擇中的主次地位，給予不同的加權(quán)系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化后的值加權(quán)后求和，即得綜合評價Y值，結(jié)果見表2。

將表1中各實驗水平的4個因素及表9中相應(yīng)實驗水平的綜合指標(biāo)Y值輸入計算機(jī)，用JYSYSJ的數(shù)據(jù)分析模塊處理，用二次多項式逐步回歸，得回歸方程：F=7.441 501-36.100 98×D+0.5288 306 ×A×A-0.703 579 2×C×C-4.506 316×D×D-0.475 532 7 ×A×C+1.087 29×B×B+7.035 472×C×D，r=0.999 998 5，F(xiàn)=49 066.55。查 F 值表 F0.05(7，1)=236.8，F(xiàn)0.05(7，1)

2.10 驗證優(yōu)化條件 按照2.9項下優(yōu)選出的工藝條件，依2.5～2.8項下各指標(biāo)的測定方法，依法進(jìn)行3次重復(fù)實驗，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，驗證實驗提取液綜合評價Y’值接近預(yù)測值（Y=12.723 5）。

3 小結(jié)與討論

1）以苦參堿、氧化苦參堿、苦參總堿、HPLC總面積、干浸膏為指標(biāo)，采用均勻設(shè)計法對藥材SBE法工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果：3煎用水pH依次為2.200 8、7.468 5、8.989 0，3 煎總計時間為 3.918 0 h。結(jié)合生產(chǎn)實際，確定其SBE法工藝條件為：3煎用水pH 依次為 2.0、7.5、9.0；提取時間依次為 2.0、1.0、1.0 h。驗證實驗結(jié)果接近預(yù)測值，說明優(yōu)選條件可行。

表3 驗證實驗提取液中各指標(biāo)成分含量的標(biāo)準(zhǔn)化值及綜合評價值Tab 3 The standard and evaluated content of each ingredient in the extracting liquid

2）實驗結(jié)果是按照半仿生提取法“有成分論，不惟成分論”理論，充分考慮到單體成分和活性混合物(多種成分)，根據(jù)各指標(biāo)在工藝選擇中的主次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，確定綜合評價Y值的關(guān)系式，并對5個指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)單位和量綱的不同，以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊造成的影響，以標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)加權(quán)后求和得Y值作為綜合指標(biāo)，優(yōu)選出SBE法最佳條件，這樣更科學(xué)，更合理。

[1] 張兆旺，孫秀梅.試論“半仿生提取法”制備中藥口服制劑[J].中國中藥雜志，1995，20（11）：670-673.

[2] 張瑞亭，張兆旺，孫秀梅.思維方式的轉(zhuǎn)換與中藥“半仿生提取法”[J].中國中藥雜志，1997，22（9）：542-544.

[3]張兆旺，孫秀梅.“半仿生提取法”的特點與應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2000，2（1）：35-38.

[4] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：141-141.

Even-designed and optimized technology for semi-bionic extraction of Sophora Flavescens

WANG Ying-zi1，HUI Jian-Guo2,ZHANG Zhao-wang2,et al
(1.Beijing University of TCM,Beijing 100102,China;2.Shandong University of TCM,Jinan 250014,China)

[Objective]To optimize the technique of semi-bionic extraction(SBE)for Sophora Flavescens.[Methods]Based on the UL（91×33）even-design,matrine,oxymatrine,total alkaloids,total area of HPLC and dry extract were used as indexes to optimize the technology of SBE for Sophora Flavescens.[Results]The pH value of 3 times of extraction is 2.2008,7.4685 and 8.9890,respectively.The total extracting time is 3.9180 hours.[Conclusion]Based on the manufacture practice,the pH value of extraction of 3 times is 2.0,7.5 and 9.0,respectively and the extracting time is 2 hours,1 hour and 1 hour in turn.

Sophora Flavescens;semi-bionic extraction;even-design;multi-component indexes;comprehensive evaluation

R284.2

A

1672-1519(2010)01-0066-03

國家自然科學(xué)基金課題（30701110）。

王英姿（1975-），女，博士，副教授，主要研究方向為中藥制劑新劑型與新技術(shù)。

2009-09-26）